Os principais instrumentos de diagnóstico para megacólon congénito são a manometria rectal, o enema de bário e a biopsia da patologia rectal. Evidentemente, as manifestações clínicas e o exame físico são a base diagnóstica mais básica. Em particular, o exame rectal é importante para o diagnóstico e exclusão do megacólon. O exame rectal pode ajudar a determinar o desenvolvimento e patologia do recto a fim de excluir dificuldades de defecação devido a um desenvolvimento rectal anormal, malformações ou factores adquiridos. Um exame rectal do dedo que parece um anel estreito ou um surto de fezes quando o dedo é retirado pode alertar-nos para uma suspeita de megacólon. A manometria anorretal mede a capacidade de reflexo de relaxamento do esfíncter interno e a pressão no canal anal. Em pessoas normais, o esfíncter interno relaxa quando as fezes são passadas, enquanto que em doentes com megacólon, o reflexo de relaxamento do esfíncter interno não pode ser produzido devido à falta de células ganglionares. A manometria anorectal usa este princípio para simular se o reflexo de relaxamento interno do esfíncter pode ser produzido durante a defecação para ajudar a diagnosticar o megacólon. Quando se suspeita de megacólon congénito, é feita uma radiografia de bário para ajudar o médico a obter informações sobre o comprimento do intestino doente e o grau de dilatação secundária do intestino da criança, a fim de permitir ao médico decidir sobre um plano de tratamento e opções cirúrgicas, pelo que este teste deve ser feito. Todas as máquinas de raios X têm actualmente um nível relativamente baixo de radiação e não afectam muito a criança. O bário é injectado no cólon principalmente através do ânus e é eliminado através da lavagem posterior do intestino. Enquanto não houver perfuração do intestino causando peritonite, não há efeito sobre o bebé. É importante notar que o megacólon congénito não pode ser diagnosticado por ultra-sons abdominais no presente caso. Se a obstipação persistir e não melhorar com vários regimes e tratamentos conservadores, o enema de bário não mostra alterações morfológicas significativas no intestino, e a manometria anorectal é ambígua, então uma biópsia patológica deve ser considerada. Existem dois tipos principais de biopsia patológica, uma é uma biopsia de mucosa rectal e a outra é uma biopsia rectal inteira. Uma delas é a biopsia da mucosa rectal, que pode ser feita no bloco operatório sob anestesia ou na enfermaria. A chave é obter tecidos suficientemente grandes e o patologista tem mais experiência de diagnóstico para ter uma melhor taxa de diagnóstico, enquanto que a biopsia da mucosa rectal acarreta também o risco de hemorragia intestinal e perfuração intestinal. Se mesmo uma biopsia da mucosa rectal não for diagnosticada, ou se a criança precisar de uma cesariana por várias razões, tais como obstrução intestinal, pode ser feita uma biopsia rectal completa, que é o padrão ouro e o último recurso para o diagnóstico de megacólon.