Objectos e métodos de teste
Temas
Grupo de casos experimentais
De Janeiro de 2012 a Outubro de 2013, 36 pacientes com glioma que foram submetidos a neurocirurgia no nosso hospital, com idades compreendidas entre 12 e 65 anos, com uma média de 39,6 anos, incluindo 20 homens e 16 mulheres, foram incluídos no grupo experimental. Os pacientes foram excluídos de doenças infecciosas, doenças neurológicas, tumores e doenças auto-imunes, e tinham funções hepáticas e renais normais e nenhum historial de trauma ou outras doenças crónicas. Todos os casos foram diagnosticados como doentes com glioma pelo departamento de patologia do nosso hospital, e todos os doentes com glioma foram divididos em grupos de grau baixo (grau I-II) e alto (grau III-IV) de acordo com a classificação de tumores cerebrais da OMS. No grupo experimental, o líquido cerebrospinal foi recolhido 24 horas antes, 24 horas depois, 72 horas depois e 120 horas após o procedimento. Após a recolha do líquido cefalorraquidiano, o exame bioquímico de rotina do líquido cefalorraquidiano foi realizado imediatamente, e as restantes amostras foram centrifugadas em 4℃ durante 10 min a 4 000×r/min, e o sobrenadante foi recolhido e armazenado imediatamente num frigorífico a -80℃ (as que continham glóbulos vermelhos foram descartadas). O grupo de controlo foi tratado da mesma forma que o grupo cirúrgico.
Grupo de controlo normal
Foram seleccionados dezoito casos de população de controlo de saúde ambulatório como grupo de controlo durante o mesmo período, com idades entre os 26 e os 65 anos, com uma média de 38,8 anos, 10 homens e 8 mulheres. Não houve diferença significativa na sua composição por sexo e idade média em comparação com o grupo experimental (P>0,05).
Método experimental
A determinação das amostras foi efectuada em estrita conformidade com as instruções do kit, e a curva de correlação foi traçada de acordo com a diferença entre o valor de DO de cada poço da placa reagente e o valor de DO do branco e da coordenada vertical, e a concentração do padrão como a coordenada horizontal.
Tratamento estatístico
Todos os dados foram expressos como média ± desvio padrão (±SD), e os dados foram analisados utilizando o software estatístico SPSS17.0.
Resultados
Níveis de IL-6, IL-10, MMP-2 e MMP-9 no LCR de doentes com glioma em comparação com os controlos, com diferenças significativas entre grupos em todos os valores medidos
Diferenças nos níveis de IL-6, IL-10, MMP-2, MMP-9 no QCA de gliomas de alto grau versus gliomas de baixo grau
Entre os 36 casos de glioma diagnosticados de acordo com a Classificação de Tumores Cerebrais da OMS (1997), registaram-se 17 casos de glioma maligno baixo a moderado (doravante referido como grupo de grau I-II) (incluindo 14 casos de astrocitoma grau I e II, 1 caso de meningioma ventricular e 2 casos de oligoblastoma) e 19 casos de glioma maligno alto (doravante referido como grau III ou superior) (incluindo 14 casos de astrocitoma grau III e IV, 2 casos de meningioma ventricular mesenquimal). (incluindo 14 casos de astrocitoma grau III e IV, 2 casos de meningioma ventricular mesenquimal, 1 caso de oligoblastoma mesenquimal e 2 casos de medulloblastoma).
Os níveis de MMP-2, MMP-9 e IL-6 no líquido cefalorraquidiano de pacientes com glioma de grau elevado eram significativamente mais elevados do que os do grupo de grau inferior. Os níveis de IL-10 no líquido cefalorraquidiano não eram significativamente diferentes entre o grupo de grau alto e o grupo de grau baixo.
Alterações na IL-6, IL-10, MMP-2 e MMP-9 ao longo do tempo em doentes com glioma após cirurgia
Os níveis de MMP-9 no líquido cefalorraquidiano de doentes com glioma medidos nesta experiência diminuíram rapidamente nas 24 horas após a cirurgia; os níveis de MMP-2 e IL-10 não se alteraram significativamente em diferentes momentos após a cirurgia; os níveis de IL-6 no líquido cefalorraquidiano diminuíram gradualmente após a cirurgia
Discussão
O glioma é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central humano. É propenso à recorrência, muitas vezes exigindo múltiplas cirurgias, e pode resultar em deficiências graves, tais como hemiplegia, afasia, atraso mental e distúrbios psiquiátricos, causando sofrimento e devastação incalculáveis às famílias. Os gliomas de alto grau como o glioblastoma e o glioma mesenquimatoso apresentam um crescimento infiltrativo difuso e têm um tempo médio de sobrevivência de pouco mais de um ano. Os tratamentos tradicionais como a cirurgia e a radioterapia dedicam-se a reduzir o tumor e a recorrência do tumor é quase inevitável. A investigação está actualmente centrada em características-chave da biologia do glioma, tais como agressividade e imunossupressão como ponto de entrada, e não apenas excisão grosseira do tumor; embora tenham sido feitos grandes progressos no estudo do glioma, a sobrevivência média só melhorou em 9,10 semanas [2]. Por conseguinte, é urgente e necessário encontrar novos alvos terapêuticos baseados nos mecanismos moleculares do desenvolvimento do glioma.
Expressão e significado da IL-6 e IL-10 nos doentes com glioma
O cérebro tem sido considerado durante muito tempo um “órgão imunitário” devido à relativa impermeabilidade da barreira hematoencefálica às células imunitárias, à falta de um sistema linfático no sistema nervoso central, e à relativa inactividade dos microglia e macrófagos intrínsecos no sistema nervoso central. A presença de imunidade activa no SNC proporcionaria uma nova direcção para o desenvolvimento de opções mais eficazes de tratamento do glioma utilizando imunoterapia específica. Para os investigadores, a capacidade da imunoterapia glioma para matar células glioma alvo sem danificar o tecido normal parece mais atractiva e promissora para a investigação. Contudo, ensaios clínicos recentes das fases I e II realizados por Wheeler et al. demonstraram resultados insatisfatórios no tratamento apesar da segurança das vacinas de células dendríticas em doentes com glioblastoma recorrente [3]. Sabe-se agora que o fracasso da imunoterapia e do sistema imunitário em visar as células tumorais se deve em grande parte à desregulação de várias citocinas imunitárias associadas ao glioma; estas citocinas levam à imunossupressão e evasão imunitária em doentes com glioma e promovem a proliferação e angiogénese das células tumorais, aumentando assim a agressividade tumoral e promovendo a progressão tumoral, bem como levando à resistência a vários tratamentos tolerância.
IL-6 e IL-10 têm recebido muita atenção como novos alvos para o tratamento dos gliomas. Nos últimos anos, foi demonstrado que as células de glioma de alto grau secretam mais destas citocinas do que as células de glioma de baixo grau, e que existe uma correlação entre os níveis de expressão e o grau de malignidade do tumor [4]. Comparámos os níveis de expressão de IL-6 e IL-10 no LCR de pacientes com diferentes graus de glioma e também encontrámos uma correlação entre os seus níveis e o grau de malignidade. Recentemente, Samaras et al. forneceram resultados de coloração imunohistoquímica mostrando que a expressão da IL-6 na GBM estava principalmente confinada a células tumorais e macrófagos e localizada dentro de grandes áreas isquémicas necróticas.
A IL-6 é uma citocina pleiotrópica que funciona em muitos processos fisiológicos e patológicos, incluindo respostas inflamatórias, metabolismo ósseo, síntese de proteína C-reactiva e hematopoiese. A IL-6 é segregada por muitos tipos de células e actua numa variedade de células alvo, regulando o desenvolvimento celular, a diferenciação e a indução de genes específicos associados a várias doenças. IL-6 é também um potencial estimulador da expressão VEGF, que é uma importante citocina pro-endotelial no desenvolvimento de gliomas.
Nesta experiência, medimos os níveis de IL-6 no líquido cefalorraquidiano dos grupos experimental e de controlo por ELISA, determinámos as suas alterações em diferentes períodos antes e depois da cirurgia, e realizámos análises estatísticas. Os resultados mostraram que os níveis de IL-6 no LCR do grupo experimental eram significativamente mais elevados do que os do grupo de controlo, confirmando a presença de activação anormal de factores inflamatórios em doentes com glioma e sugerindo um estado de lesão inflamatória crónica no organismo dos doentes com glioma. Também comparámos os níveis de IL-6 no LCR de pacientes com diferentes graus de glioma, o que mostrou uma correlação positiva com o grau de malignidade do glioma. A diminuição gradual dos níveis de IL-6 do líquido cefalorraquidiano após a cirurgia pode ser devida à redução da libertação de secreções e ao aumento do catabolismo, entre outras razões, e o papel das citocinas inflamatórias nos danos e reparações nervosas ainda é controverso.
O aumento da expressão da IL-10 foi agora encontrado numa variedade de tumores, incluindo gliomas. Alguns estudos demonstraram [5] que a IL-10 é expressa a níveis mais elevados em tumores malignos do que em tumores benignos e que se verificou que a IL-10 aumentava a proliferação e invasividade das linhas celulares de glioma em experiências in vitro e que este efeito estava relacionado com a dose. Concluíram que nos doentes com glioma, as principais fontes de IL-10 são as microglia e os macrófagos são mais do que células tumorais [6]. Vários estudos descobriram que a IL-10 reduz a apresentação antigénica por monócitos através da desregulação dos níveis do complexo antigénico II (MHC II) de histocompatibilidade importante, impedindo assim a proliferação de células T activadas por antigénios e a secreção de outros mediadores inflamatórios. Nos modelos animais, contudo, a IL-10 melhora as respostas imunitárias anti-tumorais específicas, o que levou a controvérsia sobre o papel da IL-10 no sistema imunitário. Existem dados que demonstram que a IL-10 desempenha um papel muito importante na geração de células T anti-GBM effector como imunomodulador em vez de imunossupressor [7].
Nesta experiência, os níveis de IL-10 foram medidos por ELISA e analisados estatisticamente. Os resultados mostraram um aumento significativo dos níveis de IL-10 no líquido cefalorraquidiano do grupo experimental em comparação com o grupo de controlo e também confirmaram a presença de activação do factor inflamatório em doentes com glioma. Também comparámos os níveis de IL-10 no LCR de pacientes com diferentes graus de glioma, os dados não mostraram diferença significativa e não podem ser utilizados como indicador de referência para a avaliação do grau de tumor. a falta de alteração significativa da IL-10 no líquido cefalorraquidiano de pacientes com glioma antes e depois da cirurgia durante 120 horas pode ser devida à sua baixa eficiência de depuração ou libertação sustentada, não foi encontrada qualquer alteração no seu aumento ou diminuição significativa, ou pode ser que o nosso estudo O tempo foi curto e deve ser continuado no passo seguinte.
Expressão e significado do MMP-9 e MMP-2 em doentes com glioma
MMPS é uma família de proteases cujo papel principal é degradar estruturas como a matriz extracelular e a membrana do porão, e o envolvimento de plasma Ca2+ e Zn2+ é necessário para esta função enzimática. A expressão de MMPS aumenta significativamente numa variedade de situações, tais como respostas inflamatórias e invasão de tumores e metástases, e o seu nível de expressão, a regulação pelo TIMPS e outros factores inibidores e a sua própria regulação de feedback negativo estão entre os muitos factores que podem influenciar o papel do MMPS.
Embora tanto a MMP-9 como a MMP-2 pertençam à família da metaloproteinase matricial, os seus níveis de expressão diferem significativamente no mesmo paciente com glioma. A nossa análise das razões desta diferença pode estar intimamente relacionada com as suas diferentes origens, mas a sua origem exacta não é clara e pode também estar relacionada com factores como o peso molecular, a cinética de libertação e a cinética de depuração. Um estudo [8] mostrou que a sua expressão é significativamente elevada 2h após uma lesão de isquemia-reperfusão cerebral, e sugerimos que esta protease poderia levar à abertura de BBB, perturbando as junções estreitas entre as células endoteliais e quebrando a membrana do porão dos microvasos cerebrais. A ruptura da barreira hemato-encefálica e o aumento da permeabilidade microvascular cerebral causam edema cerebral, e pode-se levantar a hipótese de que a MMP-2 e a MMP-9 estão estreitamente relacionadas com o prognóstico clínico.
MMP-9 é a maior enzima de peso molecular da família das MMPs e pode catabolizar uma variedade de proteínas tais como gelatina, colagénio tipo IV e V e elastina [9]. Neste estudo experimental, descobrimos que o nível de MMP-9 no líquido cefalorraquidiano de doentes com glioma era significativamente mais elevado do que o do grupo de controlo, e a expressão de MMP-9 no grupo de grau elevado era significativamente mais elevada do que a do grupo de grau baixo. O nível de MMP-9 no líquido cefalorraquidiano aumentou com o aumento da malignidade do tumor, e a expressão de MMP-9 pode tornar-se um indicador importante da malignidade, agressividade e prognóstico do glioma.
É de salientar no estudo da expressão da MMP-9 que a sua expressão no líquido cefalorraquidiano diminui subitamente após a cirurgia, uma característica não demonstrada por outros biomarcadores testados, que pode estar relacionada com a libertação do estado de suporte do tumor e sugere que pode ser produzido pelas próprias células tumorais ou pelas células normais circundantes estimuladas por tumores. O seu estado está estreitamente correlacionado e pode ser usado como indicador de referência para o prognóstico dos doentes com glioma. Se tem uma correlação com o tamanho do tumor necessita de mais estudo, e se tiver, proporcionará um maior valor de referência clínica.
MMP-2 é um membro importante da família MMP e proteínas hidrolisadas tais como elastina, laminina e fibronectina, que são os principais componentes das junções estreitas entre as células endoteliais e a membrana do porão da parede capilar. A decomposição destas proteínas provoca o aumento da permeabilidade da membrana do porão e a ruptura da estrutura BBB, resultando em danos patológicos, tais como edema do tecido cerebral e aumento da pressão intracraniana.
No presente estudo experimental, constatou-se que o MMP-2 foi pouco expresso em controlos normais e aumentou significativamente nos gliomas, e a diferença de expressão entre os grupos de alto e baixo grau foi estatisticamente significativa, mas não notável, sugerindo que o MMP-9 pode desempenhar um papel mais importante no crescimento agressivo dos gliomas.
Em resumo, MMP-9, MMP-2, IL-6 e IL-10 podem desempenhar um papel dominante ou decisivo na imunidade e invasão dos gliomas. Os níveis de IL-10 no líquido cefalorraquidiano de doentes com glioma não eram significativamente diferentes entre os grupos de alto e baixo grau e não podiam ser utilizados como indicador de referência do grau de glioma, enquanto a expressão de MMP-2, MMP-9 e IL-6 eram significativamente diferentes entre os grupos de alto e baixo grau e podiam ser utilizados como indicador de referência do grau de tumor de glioma. Os níveis de MMP-9 no líquido cefalorraquidiano de pacientes com glioma diminuíram significativamente nas 24 horas após a cirurgia, o que pode estar relacionado com a resolução do estado de suporte de tumores e pode ser usado como indicador bioquímico para prever o prognóstico clínico dos pacientes.