Infertilidade e baixa estatura são dois dos principais problemas para as pessoas com síndrome de Turner (TS). Nos últimos 20 anos, a hormona de crescimento recombinante (Groeth Hormorn, GH) tem sido utilizada para tratar o retardamento do crescimento, permitindo à maioria das pessoas com TS atingir a altura adulta à altura ou ligeiramente abaixo do limite inferior da população normal. Como a falha prematura dos ovários é um sintoma clássico da condição, receber a doação de óvulos e preservar os óvulos restantes tornou-se um dos tratamentos eficazes para a infertilidade.
Entre 15-30% dos pacientes de TS têm puberdade espontânea, mas apenas 2-5% dos que têm primiparidade podem engravidar, sugerindo que os folículos dos pacientes de TS têm produção de estrogénios mas desaparecem prematuramente e que o processo dinâmico do desaparecimento não foi completamente elucidado. Num estudo anterior, o tecido cortical ovariano foi biopsiado, congelado e analisado para detecção de folículos em raparigas com TS, e verificou-se que os folículos estavam presentes em 8 em cada 10 raparigas adolescentes. Actualmente, a criopreservação do tecido cortical ovariano antes do tratamento anti-cancerígeno em pacientes jovens de oncologia feminina com requisitos de fertilidade tem sido utilizada como opção para preservar os folículos primordiais para o tratamento futuro da infertilidade, e os descendentes saudáveis têm sido obtidos a partir do transplante de tecido ovariano congelado.
O objectivo deste estudo era prever a fertilidade dos doentes com TS através do congelamento do tecido ovariano e da sua avaliação clínica e hormonal, incluindo a idade, cariótipo, menstruação espontânea, hormona estimulante do folículo puberal (FSH), hormona luteinizante (LH) e níveis de hormona anti-milleriana derivada de granulócitos (AMH).
Dados clínicos
O estudo incluiu 57 pacientes com TS, com idades entre os 8-19,8 anos, referidos por 25 endocrinologistas pediátricos na Suécia (principalmente Estocolmo e Skåne no sul), e os pacientes e os seus pais foram informados dos detalhes do estudo e assinaram um termo de consentimento informado. Os doentes e as famílias foram informados em pormenor de que não era possível prever se o tecido ovariano obtido conteria óvulos para tratamento futuro da infertilidade, e foram informados de outras opções para iniciar uma família, tais como doação e adopção de óvulos, e a maioria das famílias aceitou a proposta e entrou no estudo.
Apenas 15 pessoas no centro médico com o maior número de doentes se recusaram a aderir. Acreditamos que os doentes com sinais de falha ovariana prematura também são susceptíveis de encontrar folículos, pelo que a participação de nenhum doente foi recusada. O estudo foi aprovado pelo Comité de Ética do Instituto Karolinska e foi conduzido em estrita conformidade com a Declaração de Helsínquia e a lei sueca sobre ética na investigação médica.
Excluindo sete raparigas com menos de 12 anos de idade, 19 das 50 raparigas apresentavam sinais de início espontâneo da puberdade, 13 (26%) apresentavam menarca e 21 estavam a fazer HRT. nenhum estudo confirmou ainda o volume mínimo dos ovários que podem detectar folículos, pelo que não foi realizada nenhuma ecografia ou ressonância magnética (MRI) antes da realização do estudo. Os doentes receberam hormona de crescimento humano (GH), tiroxina (T4) e terapia de reposição de estrogénios (HRT) de acordo com os protocolos de tratamento suecos.
A análise dos cromossomas linfocitários determinou o diagnóstico TS, que foi 45X em 28 casos, quimérico em 7 casos (45X/46XX/47XXX) e anormalidades estruturais (SAs) num dos cromossomas X nos restantes 22 casos, incluindo supressões de braços longos ou curtos, heterocromossomas, cromossomas circulares ou fragmentos Y. Os resultados da análise cromossómica foram fornecidos pelo centro médico onde o doente foi visto, e o número de células analisadas variou entre 15-105, dependendo da hora e do local dos testes.
O nível de detalhe nos relatórios do laboratório genético também varia, faltando mesmo alguns relatórios com informação detalhada sobre a ausência ou duplicação do braço do cromossoma X. Todos os resultados da análise cromossómica foram obtidos a partir de culturas de linfócitos, e também foi relatada alguma hibridação in situ da fluorescência (FISH) de células da mucosa bucal ou outros tecidos.
Métodos
Laparoscopia
As doentes foram submetidas a biopsia laparoscópica sob anestesia geral para obter tecido ovariano para congelação. 10 raparigas tinham ovários demasiado estriados ou demasiado pequenos para serem biopsiados ou mesmo difíceis de identificar. Nos restantes 47 doentes, 25-50% do tecido cortical de um ovário foi biopsiado.
Criopreservação
O tecido ovariano excisado foi imediatamente colocado numa cultura de fertilização in vitro contendo tampão HEPES e albumina de soro humano. 0,5-3 mm3 de córtex ovariano foi excisado para biopsia histológica e o tecido restante foi cortado em pequenas tiras, aproximadamente 0,5 x 3-5 mm, e congelado por programação lenta com o crioprotector propilenoglicol sacarose.
Biópsia histológica e contagem folicular
Um pequeno pedaço de tecido ovariano fresco de cada paciente foi cortado e fixado na solução de Bouin, embebido em parafina, seccionado e corado com hematoxilina e eosina. O número total de folículos e a densidade folicular dos espécimes biopsiados foram avaliados utilizando um sistema de análise de imagens de dados ligado a um microscópio invertido. A densidade folicular foi expressa como o número de folículos por milímetro cúbico nas amostras analisadas, e apenas os folículos normais foram contados. Normalmente a densidade folicular em raparigas saudáveis é superior a 500/mm3.
Medidas hormonais
As amostras de sangue para FSH, LH e AMH foram colhidas no dia anterior à biopsia laparoscópica em 28 casos, 19 amostras de sangue foram enviadas no prazo de um ano após a biopsia e os restantes 10 casos não tinham amostras de sangue.
O soro FSH e LH foram medidos em 47 pacientes, 43 por imunoensaio quimioluminescente (Immulite) de duas fases sólidas no Laboratório de Investigação da Saúde da Mulher do Instituto Karolinska. LH, prolactina, GH humano ou lactogénio placentário humano (HPL) sem reactividade cruzada detectável.
A sensibilidade da análise LH foi de 0,1 mIU/ml e a especificidade foi também muito elevada, sem reactividade cruzada detectável com hCG, FSH ou TSH. A sensibilidade do ensaio FSH foi de 0,7 mIU/ml, com um nível crítico amplamente utilizado na Europa, correspondendo a uma concentração de 17 IU/L. O padrão amplamente utilizado nos EUA foi calibrado de acordo com a Segunda Preparação de Referência Internacional (IRP) para o ensaio biológico FSH e hCG da OMS. Está calibrado de acordo com o segundo padrão IRP.
As concentrações de AMH foram determinadas em 43 soros infantis no Laboratório de Investigação da Saúde da Mulher, Instituto Karolinska, Suécia, utilizando um kit AMH ELISA em duas etapas. Foi utilizado o protocolo ultra-sensível recomendado pelo fabricante. Este método tem uma especificidade muito elevada para a detecção de AMH e nenhuma reactividade cruzada com TGF-β. A sensibilidade foi definida como a menor concentração de AMH que difere significativamente do padrão zero com uma probabilidade de 95% de ser 0,7 pmol/L.
Estatísticas
A sensibilidade e especificidade do teste de diagnóstico são utilizadas para calcular valores preditivos positivos e negativos, respectivamente. O valor preditivo positivo é a proporção de pacientes com um resultado positivo no teste e reflecte a sensibilidade do teste. Valor preditivo negativo é a proporção de não pacientes com um resultado negativo no teste e reflecte a especificidade do teste. Os resultados foram expressos como curvas ROC (receiver operating characteristic curve) e processados estatisticamente usando o teste χ2, com P<0,05 indicando uma diferença estatisticamente significativa.
Resultados
Laparoscopia
Todas as 57 laparoscopias foram procedimentos diurnos, ou seja, os pacientes foram admitidos de manhã e tiveram alta à tarde ou à noite, e não houve complicações anestésicas ou cirúrgicas neste estudo.
LH, FSH e AMH
Todos os pacientes foram biopsiados sem HRT em 36 casos e a HRT foi dada em 21 casos. As medições hormonais não foram efectuadas tendo em conta o artefacto da medição do hCG. O LH e FSH foram medidos em 30 casos. 17 casos tinham valores de LH e/ou FSH séricos superiores ao normal para a sua idade, dos quais 13 não tinham folículos encontrados na amostra da biopsia e os restantes 4 tinham folículos; 13 tinham valores hormonais dentro da faixa normal para a sua idade, dos quais 9 tinham folículos encontrados e 4 não tinham folículos.
Ovários com ovos
Dos 57 pacientes, 47 puderam ser biopsiados num ovário e 15 (26% do total) tinham folículos entre 0,7-1200/mm3. 6 dos 7 quimeras (86%) tinham folículos visíveis, 6 dos 22 SAs (27%) tinham folículos e 3 dos 28 cariótipos 45X (10,7%) tinham folículos. 19 pacientes com características puberais espontâneas Onze (58%) dos 19 pacientes com puberdade espontânea tinham folículos e oito (62%) dos 13 períodos menstruais espontâneos tinham folículos.
Dos 30 pacientes com mais de 12 anos sem características puberais espontâneas, verificou-se que três (10%) tinham folículos. Descobriu-se que uma rapariga de 11 anos tinha folículos, apesar da ausência de sinais pubertais óbvios.
Os cinco principais preditores positivos (sensibilidade) para prever a presença de folículos foram: cariótipo como quimérico (0,86), valor FSH de 11 mIU/ml (0,69), AMH2 pmol/L (0,64), menarca espontânea (0,62) e início espontâneo da puberdade (0,58).
Os valores preditivos negativos (especificidade) para ausência de folículos foram: cariótipo 45X (0,89), AMH2 pmol/L (0,88), ausência de início espontâneo da puberdade (0,87), menos de 12 anos (0,82), ausência de menarca espontânea (0,81), valor FSH 15 mIU/ml (0,77), mais de 16 anos (0,76), cariótipo SAs (0,73 ). Cinco dos seis factores acima referidos eram estatisticamente significativos, com o factor idade a não ser significativo, embora o valor preditivo negativo fosse mais elevado para o grupo etário mais jovem.
Conclusão
Os resultados deste estudo sugerem 5 factores importantes para a capacidade de detectar folículos nos ovários de raparigas TS: cariótipo, baixa FSH, alta AMH, menarca espontânea, e puberdade espontânea. Em conclusão, os seguintes grupos de raparigas com TS têm as maiores probabilidades de terem folículos e podem ser consideradas para biopsia laparoscópica de tecido ovariano para congelação entre os 13-17 anos de idade: 1) quimérica (45X/46XX/47XXX); 2) com puberdade espontânea e 45X ou 45X/46X+ SAs; e 3) com soro normal FSH e/ou AMH com ou sem puberdade espontânea.
Assumindo que os 3 critérios acima foram utilizados para prever os doentes neste estudo, 19 casos deveriam ter sido submetidos a laparoscopia na mesma idade, dos quais 11 tinham folículos detectáveis e 8 não tinham folículos, com uma sensibilidade de 0,58 (11/9). 15 dos doentes mais jovens, o atraso da laparoscopia significava que ainda havia 2 casos em que os folículos ainda podiam ser detectados mais tarde, pois ambos tinham características puberais. 23 doentes que não foram submetidos a laparoscopia os 2 casos com folículos poderiam não ter sido detectados de acordo com o terceiro critério. A especificidade para excluir raparigas com TS sem folículos deve ser de 0,91 (21/23).
Discussão
Não é surpreendente que os folículos possam ser encontrados na maioria dos pacientes de TS com puberdade e quimera espontânea. Inesperadamente, os folículos também estiveram presentes em três pacientes sem puberdade espontânea e em quatro pacientes com FSH elevada, LH e AMH baixa. O processo de atresia folicular e aumento das concentrações de gonadotropina nos ovários parecia ocorrer num período de sobreposição, pelo menos em alguns indivíduos, e os três casos com folículos tinham pelo menos função ovariana mas não apresentavam quaisquer sinais de puberdade, implicando que os seus pequenos folículos eram incapazes de secretar quantidades suficientes de estrogénio para desencadear o início da puberdade.
Por outro lado, dois pacientes com gonadotropinas séricas normais e AMH >2 pmol/litro não apresentaram folículos, pelo que é possível que os folículos não estivessem presentes nos pequenos espécimes que utilizavam para análise histológica, mas que estivessem presentes no tecido ovariano congelado ou noutras partes do ovário, que se sabe serem inconsistentes na sua distribuição dentro do ovário. Do mesmo modo, não foram vistos folículos nos quatro casos com níveis normais de gonadotropina e nos quatro casos com níveis elevados de AMH.
A ultra-sonografia ou a ressonância magnética pélvica não era necessária para confirmar a presença ou ausência de ovários antes da laparoscopia ser realizada neste estudo. Algumas das raparigas tinham sido submetidas a exploração transabdominal por ultra-sons no hospital local, mas os resultados e a concordância com os achados laparoscópicos foram mínimos.
Estudos anteriores também sugeriram que os resultados da ecografia transabdominal são fiáveis, em relação ao interesse especial do investigador, à formação de competências especializadas e ao bom equipamento. A RM pode ser um melhor método de detecção de tecido ovariano na prática clínica e pode ser uma opção se a biopsia laparoscópica dos ovários não for apropriada em doentes de acordo com os critérios acima mencionados. 2 casos no estudo em que os folículos falharam por não preencherem os critérios acima mencionados podem ter sido diagnosticados por RM.
É necessário considerar se se deve realizar uma biopsia quando uma rapariga com TS atinge os 13 ou 14 anos de idade, embora não haja diferença estatisticamente significativa entre a idade e a capacidade de detectar folículos. A maioria dos pacientes que atingem esta idade já compreendem as possibilidades e limitações da preservação do tecido ovariano para o futuro, e devido à experiência limitada com células armazenadas para tratamento de fertilidade, é necessário informar os pacientes de que não há garantias de que terão descendência biológica no futuro.
Como a gravidez em pacientes com TS pode aumentar o risco de complicações, deve ser discutida com a paciente e os seus pais e ela deve ser informada de que a sua gravidez exigirá um acompanhamento especial por um obstetra. As mulheres com anomalias cardíacas (insuficiência aórtica ou estenose aórtica) ou hipertensão estão em risco significativamente aumentado de aneurismas de coarctação da aorta fatais, mas é necessária mais investigação.
Existe uma escassez de literatura sobre se existe um risco acrescido de anomalias cromossómicas na descendência de doentes com TS, pelo que a avaliação deste risco ainda não é fiável. Embora os pacientes de TS tenham sido informados em pormenor, tanto verbalmente como por escrito, do seu acesso limitado aos descendentes e dos vários riscos conhecidos e desconhecidos de gravidezes futuras, é fácil recrutar tais raparigas para o estudo, uma vez que os pacientes parecem estar dispostos a fazer o que puderem desde que o tratamento de fertilidade seja tecnicamente possível mais tarde. A partir da idade de 13-14 anos, estes pacientes podem tornar-se eles próprios participantes activos, enquanto que no caso de raparigas mais jovens, a decisão final deve ser tomada pelos seus pais.
Após a fertilização in vitro bem sucedida de folículos congelados, todas as mulheres com TS devem ser submetidas ao diagnóstico genético pré-implantação (PGD), à amostragem de vilosidades coriónicas ou à cariotipagem por amniocentese durante a gravidez, quando as condições o permitirem. A experiência deste estudo reforça a nossa convicção de que a biopsia e o armazenamento de ovários numa idade jovem em doentes com TS é um passo muito importante na gestão da infertilidade nesta população.