Nos últimos anos, à medida que a investigação sobre tecnologia de engenharia de tecidos ósseos para o tratamento de defeitos ósseos tem vindo a intensificar-se, a investigação sobre células de sementes ósseas artificiais, especialmente células progenitoras endoteliais vasculares, também tem vindo a intensificar-se. Este documento analisa o progresso da investigação sobre a origem, propriedades biológicas, mecanismo de melhoria da neogénese vascular, papel na reparação óssea, tratamento e aplicações das células progenitoras endoteliais vasculares.
A reparação óssea é uma actividade fisiopatológica complexa envolvendo uma variedade de células e matriz extracelular, e regulada por uma variedade de factores de crescimento e hormonas. Nos últimos anos, as técnicas de engenharia de tecidos ósseos tornaram-se o foco da investigação na reparação de defeitos ósseos, com grande parte da investigação centrada na selecção e cultura de células de sementes. As células progenitoras endoteliais (CPEs) foram relatadas pela primeira vez por Asahara em 1997. Esta descoberta actualizou a teoria tradicional da angiogénese pós-natal e reparação de lesões vasculares, e proporcionou uma nova forma de pensar para o tratamento de doenças isquémicas.
1. a origem dos EPCs
É agora geralmente aceite que as EPCs e as células estaminais hematopoiéticas são originárias de uma célula estaminal comum, o hemangio-gioblastos. Embora a definição e origem das EPCs ainda sejam controversas, a maioria dos estudos sugere que as EPCs derivam principalmente de sangue de veias umbilicais, sangue periférico adulto e medula óssea, sendo as EPCs em sangue periférico originário da medula óssea e as EPCs em sangue umbilical originário do fígado fetal. Em condições normais, o número de EPCs é muito pequeno, cerca de 2-3/mL no sangue periférico e cerca de 3,5 vezes mais elevado no sangue do cordão umbilical. Podem proliferar e expandir-se em grande número em condições de cultura adequadas para o crescimento de EPC, incluindo o factor de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e o factor de crescimento do fibroblasto (FGF). Asahara et al[1] relataram que os EPCs são um grupo de células com características errantes, incluindo CD34, CD133, VEGF, Fibroblast Growth Factor (FGF), FGF, etc. Asahara et al[1] relataram que os EPCs são um grupo de células precursoras com características errantes, positivas para marcadores de superfície tais como CD34, CD133 e VEGFR-2+, e podem proliferar e diferenciar-se em células endoteliais vasculares após cultura in vitro. Não estão apenas envolvidos na angiogénese embrionária, mas também existem no sangue do cordão umbilical, sangue periférico e medula óssea, e têm um forte efeito pró-angiogénico durante a angiogénese pós-natal e formam EPCs neovasculares de uma forma angiogénica.
2. propriedades biológicas das EPCs
2.1 Marcadores de Superfície de EPC
Não existe um marcador de superfície específico para a identificação de EPC, mas a maioria dos estudiosos acredita que as células CD34+ são as células progenitoras comuns das células estaminais hematopoiéticas e das células progenitoras endoteliais. A célula progenitora (MAPC) é a fonte dos EPCs. Pode diferenciar-se em células angiogénicas CD34+, CD133+, VEGFR-2+ e Flk1+ em resposta ao VEGF, FGF e IGF-Ⅰ e pode continuar a diferenciar-se em células endoteliais vasculares maduras, tornando-o uma importante fonte de células endoteliais.
Os estudos iniciais definiram EPCs como células que expressam tanto o marcador de superfície das células estaminais hematopoiéticas CD34 como o marcador de superfície das células endoteliais receptor-2 do factor de crescimento vascular endotelial (VEGFR-2). Subsequentemente, Peichev et al. descobriram que o antigénio CD133 só estava presente nas células precursoras do endotélio vascular e que as células endoteliais maduras não exprimiam o CD133; por conseguinte, referiam-se às células que exprimiam CD34+, VEGFR-2+, e CD133+ como células progenitoras vasculares funcionais. Contudo, alguns autores propuseram uma visão diferente. Harraz et al. descobriram durante as suas experiências que as células CD34- células gradualmente diferenciadas em células endoteliais em culturas condicionadas (culturas em que as células CD34+ tinham sido cultivadas), e portanto concluíram que as células CD34+ segregavam certos factores desconhecidos para estimular a diferenciação das células CD34- células em direcção às células endoteliais.
Rehman et al. relataram que os CEM de medula óssea e os monócitos CD34-CD14+ também poderiam formar células endoteliais vasculares funcionais in vitro após indução por VEGF e outros factores. Foi também relatada a diferenciação induzida das células endoteliais dos macrófagos mononucleares.
2.2 Mobilização dos EPCs
A mobilização de células progenitoras na medula óssea é ditada pelo ambiente local. A mobilização de citocinas tais como elastase, histone G e a família protease matricial (MMPs) impede a interacção entre as células estaminais e as células do estroma ao remover a ligação das aderências nas células do estroma, com a acção das integrinas de células estaminais hematopoiéticas, o que, em última análise, permite que as células estaminais saiam da medula óssea através da migração transendotelial.
Fisiologicamente, pensa-se que a isquemia pode ser um sinal para induzir a mobilização de EPCs de medula óssea. Assim, a isquemia pode upregular o VEGF e libertá-lo na circulação e induzir a mobilização de células precursoras de medula óssea através da dependência de MMP-9. Em hematologia, foram identificados outros factores, incluindo a mobilização de células estaminais da medula óssea, tais como a colheita de células estaminais hematopoiéticas do sangue periférico para transplante de medula óssea. Além disso, a eritropoietina (EPO) estimula a proliferação e maturação de eritrócitos e, em ratos e humanos, aumenta o número de células progenitoras endoteliais no sangue periférico. A relação entre os níveis séricos de EPO e as células estaminais CD34+ ou CD133+ na medula óssea de pacientes com doença cardíaca isquémica apoia um papel importante para os níveis endógenos de EPO como um indicador fisiológico da mobilização de EPCs.
No entanto, não é claro qual o factor de mobilização mais importante para aumentar as EPC. Em estudos com animais, o VEGF165 mobilizou rapidamente células estaminais hematopoiéticas e células progenitoras endoteliais circulantes, enquanto a angiopoietina-1 (ANG-1) induziu uma mobilização atrasada e mais fraca de células progenitoras endoteliais e hematopoiéticas. Além disso, as primeiras provas de modulação farmacológica dos níveis de EPC foram fornecidas por estudos com o medicamento ateroprotector MG-CoA redutase inibidores (estatinas).
Estudos demonstraram que as estatinas aumentam o número e a actividade funcional das EPC em ratos e pacientes com doença arterial coronária estável in vitro. As estatinas podem aumentar o número de células estaminais na medula óssea, aumentar o número de EPCs e melhorar a função das EPCs, incluindo a proliferação de EPCs, a mobilização de EPCs e a prevenção da senescência e da apoptose de EPCs.
2.3 Diferenciação dos EPCs
Koyanagi et al. descobriram que a calmodulin E e N foram expressas na superfície de contacto dos EPCs-cardiomiócitos num sistema de co-cultura, e que o bloqueio da calmodulin E inibiu a transdiferenciação dos EPCs, indicando o efeito das interacções intercelulares na transdiferenciação dos EPCs. Do mesmo modo, a noção de transdiferenciação em cardiomiócitos foi recentemente questionada, uma vez que Sales et al. mostraram que os EPC induzidos por TGF-ß1 in vitro para 10-15 d poderiam mudar de um fenótipo endotelial (CD31+/vWF+/αSMA-) para um fenótipo mesenquimal (CD31+/α-SMA+), ao mesmo tempo que segregam lamina, fibronectina e colagénio tipo I e III. Contudo, são necessários mais estudos para confirmar que as EPCs são transdiferenciadas em MSCs e não derivam de células precursoras de MSC que podem ser misturadas com EPCs ou por fusão celular. Os EPC expressaram marcadores de células musculares lisas superiores às células endoteliais maduras e foram induzidos pela PDGF-BB a diferenciarem-se em células musculares lisas de diferentes fenótipos (contráteis ou sintéticas), sugerindo que podem também diferenciar-se em células musculares lisas vasculares.
Todos estes estudos sugerem que o destino das EPCs não é necessariamente linear, mas pode seguir outras vias de diferenciação sob certas condições, o que significa que o “estado das EPCs” partilhado por diferentes células é dinâmico e instável, e pode mudar para outros estados de células estaminais (progenitoras) progenitoras sob a influência de factores ambientais externos, e diferenciar-se em Os EPCs são dinamicamente instáveis.
3. o papel das EPCs na reparação óssea
3.1 Mecanismos pelos quais os EPCs melhoram a angiogénese
Embora o papel das EPCs na angiogénese tenha sido demonstrado, a questão permanece quanto à forma como as EPCs promovem a angiogénese. Na ausência de lesão dos tecidos, o papel das células progenitoras é fraco, mas nos tecidos isquémicos, as células geneticamente rotuladas como derivadas da medula óssea podem co-expressar proteínas marcadoras para CE com uma grande variação nos seus efeitos (variando de 0% a 90%). Do mesmo modo, qual é o papel das células derivadas da medula óssea no tecido cerebral pós-choque? Os relatórios na literatura variam consideravelmente.
Em dois estudos, um resultou numa média de 34% de células positivas derivadas da medula óssea expressando marcadores endoteliais, enquanto o outro não detectou células expressando marcadores endoteliais, com um grande número (50%) a ser detectado principalmente em modelos de angiogénese tumoral. Alguns estudos detectaram apenas células derivadas da medula óssea na proximidade de vasos sanguíneos, mas não exprimiram proteínas marcadoras endoteliais. Uma explicação possível é que o modelo de isquemia (por exemplo, o grau de lesão ou isquemia) afecta significativamente o papel destas células. A isquemia ligeira pode dificilmente induzir a mobilização de células progenitoras endoteliais, mas apenas um pequeno número de células progenitoras mielóides são induzidas a agir. Os efeitos do transplante de células também podem variar dependendo da subpopulação de células (por exemplo, células estaminais hematopoiéticas puras versus células da medula óssea). De facto, a administração intravenosa de células mononucleares purificadas da medula óssea ou de células progenitoras endoteliais expandidas produz melhores resultados do que a mobilização interna de células transplantadas de medula óssea.
Células derivadas da medula óssea positivas de Tie-2 podem bloquear a angiogénese tumoral activando genes suicidas, e embora estas células se integrem na vasculatura tumoral, podem ser detectadas nas proximidades da vasculatura. Assim, os EPC podem agir de forma semelhante aos monócitos ou macrófagos, na medida em que podem aumentar a angiogénese, fornecendo citocinas e factores de crescimento. Estudos têm demonstrado que EPCs de cultura de diferentes origens podem expressar factores de crescimento como VEGF, HGF e IGF-1. Os monócitos aderentes podem ser cultivados em condições semelhantes e libertar VEGF, HGF e G-CSF, mas não podem expressar proteínas marcadoras endoteliais; os EPCs podem ser incorporados na estrutura da neovasculatura, sugerindo que estão envolvidos na expressão de proteínas marcadoras endoteliais in vivo; enquanto os macrófagos, que também podem libertar factores de crescimento mas não podem ser incorporados na estrutura vascular, só podem induzir um pequeno aumento na neovascularização do tecido pós-isquémico. Foi induzido um pequeno aumento na neovascularização do tecido pós-isquémico.
Os estudos acima referidos não confirmaram a capacidade dos EPCs de participar na formação de estruturas semelhantes às vasculares in vivo, mas melhoraram a condição de neovascularização.
3.2 O papel das EPCs na reparação óssea
Os EPC podem estar envolvidos na neovascularização e renovação celular endotelial através de mecanismos como a integração, fusão e secreção parácrina, e actuar como células semente em engenharia de tecidos para promover a vascularização in vivo do osso artificial dos tecidos. Os três processos básicos que se seguem ao enxerto ósseo são a vascularização do enxerto, a regeneração óssea e a fusão da extremidade óssea, dos quais a vascularização é um componente-chave, actuando ao longo de todo o processo de reparação do enxerto e determinando o modo e efeito da regeneração e fusão óssea. Após a construção in vitro de ossos tissueengineered, especialmente em grandes volumes, deve ser rapidamente estabelecido um fornecimento de sangue adequado para trazer células precursoras de osteoblastos, factores relacionados, nutrientes e outras células envolvidas na reparação óssea para o microambiente local e para transportar resíduos metabólicos e produtos de necrose e decomposição, fornecendo nutrientes para a sobrevivência e desenvolvimento das células-semente e mantendo um ambiente fisiológico conducente a este processo como um todo. O microambiente metabólico é mantido como um todo para facilitar este processo fisiológico.
A abordagem básica da engenharia de tecidos ósseos é a inoculação de células semente com biomaterial reabsorvível para formar um complexo de andaime celular para implantação no corpo. À medida que o material do andaime se degrada, as células semente continuam a proliferar e a diferenciar-se, secretam matriz e libertam citocinas, acelerando assim a reparação de defeitos ósseos. Actualmente, existem muitos estudos para promover a vascularização in vivo do osso tecidual. Os mais comuns incluem: método do feixe vascular enrolado, encapsulamento muscular pré-construído com pontas vasculares, método de enrolamento da fascia da ponta vascular, células progenitoras vasculares compostas ou células endoteliais vasculares, bem como modificação estrutural em 3D de materiais de andaimes para facilitar a vascularização e a transfecção genética e técnicas de libertação lenta/controlada de factores bioactivos pró-angiogénicos. A utilização da mobilização de factores de estimulação de colónias de granulócitos foi considerada eficaz no aumento do número de EPCs circulantes e na melhoria da endotelização de materiais artificiais de implantes. Estudos demonstraram também que as EPCs podem ser utilizadas como células semente em engenharia de tecidos para promover a vascularização in vivo do osso da engenharia de tecidos e facilitar a reparação óssea.
3.3 EPCs na reparação óssea para tratamento e aplicação
A engenharia de tecidos é simplesmente o cultivo in vitro de células funcionalmente relevantes cultivadas em andaimes naturais ou sintéticos a fim de obter novos tecidos e órgãos funcionais, mas a maioria dos tecidos e órgãos requer uma rede microvascular para fornecer nutrientes e transportar metabólitos.
Schmidt et al. isolaram e cultivaram células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical humano e inocularam-nas juntamente com células musculares lisas vasculares humanas num andaime e descobriram que podiam formar estruturas semelhantes a capilares em copolímeros de ácido poliglicólico poliláctico. Schultheiss et al. construíram uma bexiga com engenharia de tecidos inoculando células musculares lisas e células epiteliais da bexiga com segmentos decelularizados do intestino delgado suíno que mantinham a sua estrutura vascular. Numa área importante da investigação em engenharia de tecidos, a investigação em engenharia de tecidos ósseos tem produzido resultados interessantes em várias frentes e tem sido utilizada em aplicações clínicas iniciais, sendo considerada uma das áreas mais promissoras e viáveis da engenharia de tecidos.
Estes estudos experimentais sugerem que a utilização de células progenitoras endoteliais vasculares para construir osso tecidular é promissora e tem um grande potencial para o tratamento de defeitos ósseos de segmento longo.
4. conclusão e perspectivas
As células progenitoras endoteliais vasculares têm uma aplicação muito promissora no campo da engenharia de tecidos, mas a investigação só agora começou e ainda há muitos problemas a resolver, tais como marcadores de superfície e sistemas de cultura óptimos. Acredita-se que a investigação futura levará a descobertas no seu fenótipo vascular, papel na remodelação de tecidos e propriedades biológicas, e na aplicação destas células para melhorar a eficiência terapêutica e reduzir os efeitos adversos. Como membro das células-semente de engenharia de tecidos, as EPC têm demonstrado grande potencial para aplicação clínica em medicina regenerativa com o surgimento de conceitos de terapia celular autóloga e de modificação genética.