O tratamento biológico da degeneração discal inclui muitas abordagens terapêuticas diferentes. Em termos gerais, as abordagens terapêuticas incluem aplicações celulares, matriciais e moleculares, e este capítulo centra-se nas terapias moleculares. As moléculas terapêuticas englobam toda a gama de moléculas terapêuticas e não apenas os clássicos “factores de crescimento”. Esta nomenclatura é importante porque os factores de crescimento são nomeados pelo seu efeito na mitose celular, mas o efeito terapêutico das moléculas terapêuticas eficazes nem sempre é alcançado afectando a replicação celular. As moléculas terapêuticas podem ser classificadas como antimetabolitos, factores pró-apoptóticos, condroformadores, e moléculas reguladoras intracelulares. Este capítulo examina a literatura principal e define cada uma destas classificações. Uma compreensão do processo de degeneração discal é útil para compreender a terapia molecular. O processo de degeneração do disco inclui a perda de proteoglicanos, água e colagénio tipo II da matriz do núcleo pulposus. Algumas das mudanças incertas na matriz, tais como proteoglicanos poliméricos e outras, são difíceis de quantificar. As alterações nos anéis fibrosos incluem a ruptura das laminas anulares e defeitos na matriz de colagénio. Geralmente, estas mudanças de matriz levam muitos anos e são principalmente causadas por um desequilíbrio entre a síntese e o catabolismo. O objectivo da terapia molecular é parar as mudanças na matriz extracelular do disco, equilibrando a síntese e o catabolismo. As classificações específicas são as seguintes. I. Efeitos anti-metabólicos A perda de matriz é um equilíbrio entre síntese e catabolismo, pelo que a matriz extracelular do disco pode ser aumentada aumentando a síntese ou diminuindo o catabolismo. Uma abordagem é prevenir a perda de matriz através da inibição da actividade das enzimas catabólicas. Existem muitas enzimas catabólicas na matriz extracelular, das quais as metaloproteinases de matriz (MMPs) são o grupo mais importante, desempenhando um papel importante na reciclagem de moléculas de matriz extracelular e na degeneração de discos. Esta hipótese é suportada pelos níveis significativamente mais elevados de MMPs em discos degenerados. Na matriz extracelular, os inibidores das MMPs são principalmente inibidores de tecido das metaloproteinases de matriz (TIMPs), e Wallach testou se estas moléculas anti-catabólicas (TIMP-1) poderiam aumentar a quantidade de proteoglicanos na matriz através de uma via de transdução do gene adenoviral in vitro. Ele descobriu que a expressão do TIMP-1 em células de disco intervertebrais aumentou a quantidade de proteoglicanos, e também que a taxa de síntese de proteoglicanos foi aumentada por medição. Outra molécula potente é a CPA-926, uma precursora da hesperidina mas com melhores propriedades farmacocinéticas. a CPA-926 tem propriedades anti-inflamatórias e anti-tumorais e previne a degeneração das cartilagens na osteoartrite. okuma mostrou que a CPA-926 pode prevenir ou retardar o início da degeneração discal elevada dando-a oralmente aos coelhos com degeneração discal e encontrou evidência histológica da degeneração discal. A taxa metabólica da matriz é também importante no contexto de um equilíbrio entre a síntese e o catabolismo. Por exemplo, a taxa metabólica do disco é significativamente mais elevada nos jovens do que nos mais velhos, o que também pode causar alterações na composição da matriz, tais como proteoglicanos agregados degenerados e proteoglicanos agregados recentemente sintetizados (a partir da cartilagem). A taxa metabólica total também pode influenciar as necessidades nutricionais das células de disco. As citocinas, tais como IL-1 e TNF-a, têm ambas um papel importante no metabolismo do disco. Contudo, algumas moléculas como o IL-1Ra e o infliximab podem bloquear os efeitos do IL-1 e do TNF-a respectivamente e são também úteis do ponto de vista terapêutico. Mais investigação em moléculas antimetabólicas pode levar a mais descobertas. II. Factores pró-apoptóticos Os factores pró-apoptóticos são uma classe de moléculas que aumentam a taxa mitótica das células, constituem os verdadeiros factores de crescimento e por isso podemos distinguir os factores de crescimento pró-apoptóticos das moléculas condrogénicas, que incluem o factor de crescimento semelhante à insulina (IGF-1), o factor de crescimento epidérmico (EGF), e o factor de crescimento fibroblástico (FGF). Thompson demonstrou in vitro em células de disco intervertebral de cães adultos que o IGF aumentava a taxa mitótica e a taxa de síntese proteoglicana das células, sendo o EGF geralmente mais potente. os níveis de IGF-1 em discos intervertebrais de ratos diminuíram com a idade, pelo que os investigadores concluíram que a síntese matricial poderia ser aumentada aumentando o IGF-1 em discos mais antigos. os resultados dos ensaios in vivo de Walsh com factores de crescimento num modelo degenerativo de compressão do disco caudal em ratos foram consistentes com os resultados in vitro de Thompson, ambos demonstrando um ligeiro efeito do IGF-1, enquanto o FGF não teve essencialmente qualquer efeito. Outros factores de crescimento podem também impedir a apoptose das células discal pelo mesmo mecanismo ou por mecanismos diferentes. A gruber demonstrou que as células discal são apoptóticas num ambiente de baixo soro in vitro, mas a adição de IGF-1 ou PDGF reduziu a taxa de apoptose. O igf-1 tem um efeito pró-sintético mas também pró-catabólico. Nos ensaios de cultura de tecidos, o IGF-1 reduziu os níveis de TIMP-2, pelo que se diz ter um efeito duplo no metabolismo da matriz do disco intervertebral III. Hormona formadora de condrócitos A hormona formadora de condrócitos é uma classe de citocinas com capacidade pró-apoptótica, mas com uma característica primária de fenótipos específicos de condrócitos crescentes. Estas propriedades específicas dos condrócitos são determinadas pelo colagénio tipo II, o gene Sox9, proteoglicanos agregados, e Aminoglucano sulfatado. Grande parte da investigação sobre os elementos formadores de condrócitos tem sido sobre factores de crescimento transformadores (TGF-b), proteínas osteogénicas (BMPs), e factores de diferenciação de crescimento (GDFs). As hormonas formadoras de condrócitos chamaram a atenção devido à sua capacidade de inverter o fenótipo fibroso das células normais do disco intervertebral para um fenótipo condrócito. Estas moléculas actuam de forma autocrina, parácrina e endócrina, e são capazes de exercer grandes efeitos através da difusão e actuação em diferentes células. A actividade dos formadores de condrócitos prototípicos é determinada pelos receptores de superfície extracelular e sistemas activos de mensagens intracelulares das células envolvidas, enquanto que as células de disco intervertebral são capazes de expressar TGF, moléculas e receptores BMP, e o nível de expressão muda com o envelhecimento do disco. TGF-b1 foi a primeira molécula formadora de discos a ser identificada, e Thompson relatou que TGF-b1 era não só uma molécula mitogénica mas também uma molécula anabólica capaz de aumentar a síntese de proteoglicanos celulares, e que a sua capacidade de aumentar a síntese de proteoglicanos era superior à dos factores de crescimento como EGF, IGF-1, PDGF e FGF. Mais tarde, Nishida demonstrou que um vector adenoviral portador do gene TGF-b1 poderia ser injectado directamente nos discos intervertebrais dos coelhos imunes e poderia aumentar a síntese proteoglicana ao exprimir o TGF-b1. Ensaios in vitro com células de disco degeneradas humanas também demonstraram que o TGF-b1 aumentou a taxa de síntese de proteoglicanos e colagénio, sugerindo que as células de disco degeneradas ainda são sensíveis ao TGF-b1. Os ensaios in vitro em células de disco caudal de ratazanas demonstraram um efeito proliferativo de TGF-b1 nas células internas do fibro-ring, mas não alterou significativamente a altura do disco. Embora o TGF-b1 tenha este efeito, o seu papel nos discos intervertebrais humanos vivos continua por provar. O BMP-2 é outro elemento prototípico de formação de condrócitos, e Hutton relatou que o BMP-2 humano recombinante aumentou a síntese de proteoglicanos em células de disco de rato e aumentou significativamente o fenótipo de condrócitos de células de disco, bem como aumentou a expressão genética de proteoglicanos agregados e colagénio tipo II, mas não houve alterações significativas no colagénio tipo I. Kim relatou que o BMP-2 inverteu parcialmente o efeito inibidor da nicotina na síntese proteoglicana de células de discos intervertebrais, pois é sabido que o BMP-2 promove a diferenciação terminal dos osteoblastos durante a formação óssea, mas falta mostrar se o BMP-2 também promove a diferenciação das células de discos intervertebrais, como demonstrado por testes in vitro em células de discos intervertebrais humanos, onde o BMP-2 aumentou a expressão dos genes condrócitos mas não teve qualquer efeito nos genes osteoblastos. O efeito pró-anabólico do BMP-2 foi ainda demonstrado pela aplicação selectiva da terapia genética às células discal intervertebrais in vitro durante a cirurgia à coluna vertebral. Até à data, ainda não existem estudos sobre os efeitos do BMP-2 em discos degenerados humanos vivos, o que é um tema de investigação muito debatido. A BMP-7 (também conhecida como proteína osteogénica OP-1) é também um citoformador de disco intervertebral, e Masuda relatou uma relação dose-dependente entre o crescimento de células de disco intervertebral de anel fibroso de coelho e origem de núcleo pulposo e BMP-7 in vitro. Takegami demonstrou que o crescimento de células de disco de rato num ambiente de alginato com a adição do factor inflamatório IL-1 resultou numa perda de proteoglicano e colagénio no alginato, enquanto que o proteoglicano e colagénio no meio após a adição de 200 mg/ml de BMP-7 era ainda mais elevado do que na ausência de IL-1. Zhang relatou uma proliferação crescente das três fracções de células do disco intervertebral bovino (da zona externa do anel fibroso, zona interna e núcleo pulposo, respectivamente) cultivadas in vitro em resposta ao BMP-7. No entanto, apenas as células da zona externa do anel fibroso e do núcleo pulposo mostraram uma taxa aumentada de síntese proteoglicana. Foram iniciados ensaios de BMP-7 num modelo de degeneração de disco de coelho e estes ensaios demonstraram que a injecção intradiscal directa de BMP-7 aumenta a altura do disco e os níveis de proteoglicanos em coelhos. Os dados destes ensaios sugerem também que a injecção intradiscal de BMP-7 também é eficaz na degeneração de discos em ratos. BMP-13 é também conhecido como factor de diferenciação do crescimento (GDF-6) ou proteína morfogenética-2 derivada da cartilagem (CDMP-2). Embora o BMP-13 pertença à família BMP, a sua sequência de aminoácidos é apenas 50% homóloga ao BMP-2. Embora o BMP-13 não se sinergize com o BMP-2 na síntese proteoglicana e na expressão do gene condrócito, o seu efeito combinado é cumulativo. A BMP-13 não é uma proteína recombinante que possa ser produzida em grandes quantidades, tornando os estudos que requerem grandes quantidades de BMP-13 difíceis de completar. Walsh comparou os efeitos do GDF-5, TGF-b1, IGF-1 e FGF num modelo de ratos da degeneração caudal do disco e descobriu que o GDF-5 era a única molécula que aumentava a altura do disco em comparação com o controlo salino. Além disso, verificou-se a proliferação de células na banda medial e zona migratória do anel fibroso em secções de tecido. No entanto, as injecções repetidas eram propensas a uma resposta inflamatória, que os autores atribuem à lesão por injecção e não ao GDF-5, uma vez que a mesma resposta inflamatória foi observada mesmo no grupo de controlo salino.Wang utilizou a terapia genética para demonstrar que a transdução adenoviral de GDF-5 promove o crescimento de células de disco cultivadas in vitro.GDF-5 está a ser desenvolvido comercialmente para fusão espinal, no entanto, ainda é necessário um grande número de proteínas recombinantes para estudos de ensaios clínicos. O Link N é um fragmento amino-terminal da proteína linker, que Mwale demonstrou ter actividade estimulante nas células do disco intervertebral. ensaios de cultura de peletes mostraram que o Link N aumenta a síntese proteoglicana mas não o número de células, com um aumento de 113% no colagénio tipo II nas células derivadas do núcleo pulposus e um aumento de 25% nas células derivadas do anel fibriloso. O mecanismo pelo qual o Link N induz a upregulação específica de um marcador importante de condrócitos (colagénio tipo II) mas não aumenta o número de células permanece pouco claro. Contudo, estas descobertas já sugerem que o Link N é também um formulador pró-condrogénico. As moléculas reguladoras intracelulares são uma classe especial de moléculas que não actuam através de receptores transmembrana. Não são citoquinas nem factores de crescimento, mas têm o mesmo papel que as moléculas segregadas discutidas anteriormente. Estas moléculas controlam geralmente uma ou mais direcções de diferenciação celular. Os SMAD, por exemplo, são uma classe de moléculas intracelulares que regulam o BMP-R. Embora ainda não haja nada escrito sobre o papel dos SMAD nas células de disco intervertebrais, foi levantada a hipótese de que também pode ter o mesmo efeito nas células de disco que o BMP-2 no aumento do proteoglicano e na síntese de colagénio tipo II. Paul demonstrou que a transdução adenoviral do gene Sox9 aumentou a expressão de Sox9 e a síntese de colagénio tipo II em células de discos intervertebrais in vitro. Quando injectado no corpo, o adenovírus portador de Sox9 impediu alterações degenerativas num modelo de coelho do disco intervertebral anula os fibrosos do disco. O modelo de disco degenerativo foi utilizado com uma agulha de punção de calibre 27, o que causou danos mínimos ao disco e, portanto, produziu uma degeneração mínima. A principal conclusão deste ensaio in vivo foi que os discos tratados com Sox-9 tinham um fenótipo mais condrócito em comparação com o grupo de controlo; contudo, este relatório não apresenta dados quantitativos sobre o seu efeito na matriz do disco ou na composição do ensaio in vivo. A proteína de mineralização (LMP-1) é uma classe de moléculas intracelulares identificadas pelo seu papel na promoção da formação óssea e diferenciação osteoblástica. yoon descobriu que nas células de discos intervertebrais, a LMP-1 upregulou a produção de BMP-2, BMP-7, e proteoglicanos não só em culturas monocamadas mas também em ensaios prolongados (3 semanas) de cultura de alginato. Yoon demonstrou que o mecanismo de acção do LMP-1 é dependente do BMP. Experiências in vivo subsequentes em discos intervertebrais de coelhos demonstraram que pequenas doses de adenovírus transdutores de LMP-1 aumentaram os níveis de mRNA de BMP-2, BMP-7 e proteoglicanos no tecido do disco intervertebral. Como a LMP-1 estimula a formação de heterodímeros de BMP-2 e BMP-7, o seu efeito é 20 vezes maior do que o dos homodímeros. É feita a hipótese de que uma redução do risco de terapia genética adenoviral pode ser alcançada através da redução da dose de adenovírus sob o efeito de super BMP induzido. V. Resumo As moléculas utilizadas para a degeneração do disco já não são apenas os factores clássicos de crescimento, existem pelo menos quatro classes de moléculas que têm um efeito restaurador sobre o disco. Existem antimetabolitos, factores pró-apoptóticos, formogénicos derivados de condrócitos, e moléculas reguladoras intracelulares. Embora existam poucos dados de testes in vitro e muito poucos resultados in vivo de modelos animais de degeneração discal, os actuais testes de rastreio estão a chegar ao fim e, num futuro próximo, os estudos em modelos animais de degeneração discal começarão antes dos estudos em humanos.