A fibrose hepática é o resultado de uma estimulação prolongada do fígado por factores prejudiciais e acabará por evoluir para cirrose. Como os mecanismos moleculares da fibrose hepática são mais bem compreendidos, é cada vez mais aceite que a fibrose hepática é um processo reversível. Em 1995, os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) concluíram que o desenvolvimento da tecnologia de vectores, o estudo dos mecanismos moleculares da doença e o desenvolvimento de modelos animais deveriam ser a direcção certa para a investigação da terapia genética. Este artigo centra-se no mecanismo molecular da fibrose hepática e na aplicação da tecnologia de vectores na terapia genética da fibrose hepática. 1.1 Regulação das células esteladas hepáticas A activação e proliferação de células esteladas hepáticas (HSC) são centrais para o desenvolvimento da fibrose hepática e são uma via comum. HSC activada express alfa-lisa (α-SMA) e proteína glial fibrilária ácida (GFAP). A HSC activada pode secretar vários componentes de matriz extracelular (ECM) do processo fibrótico, incluindo colagénio dos tipos I, III e IV, laminina, etc. A HSC activada pode também secretar metaloproteinase de matriz (MMP) e os seus inibidores de tecido de metaloproteinase de matriz inibidora A HSC activada pode também secretar metaloproteinase matricial (MMP) e os seus inibidores do tecido inibidor das metaloproteinases (TIMP), causando uma relativa falta de degradação do ECM e deposição excessiva no fígado, levando à formação de fibrose hepática. Por conseguinte, a regulação da activação e proliferação do HSC é uma abordagem importante da terapia genética para a fibrose hepática. 1.1.1 Inibição da activação da HSC Como o stress oxidativo e as respostas inflamatórias no fígado são as ligações iniciadoras no desenvolvimento da fibrose hepática, muitos factores inflamatórios podem activar a HSC e levar ao desenvolvimento da fibrose hepática. Foram encontrados antioxidantes como o Silibum, fosfatidilcolina de leguminosas e S-adenosil-L-metionina para reduzir a extensão da fibrose hepática através da inibição da activação do HSC. Chen et al. demonstraram que o IFN-α inibiu efectivamente a activação do HSC e reduziu a expressão dos níveis de α-SMA e mRNA de TIMP-1 e factor de crescimento transformador (TGF-β) nas células HSC. Outras citocinas tais como tretinoína A, ácido glicirretínico, palmitato de retinilo e resveratrol também demonstraram inibir a activação do HSC. TGF-β é o estimulador mais eficaz da activação do HSC. Durante a lesão hepática, o ECM liberta TGF-β, que promove a activação de HSC mas inibe a proliferação de HSC, inibe a proliferação de hepatócitos e induz a apoptose; TGF-β promove a síntese de colagénio através da via de sinalização Smad, inibe a síntese de MMP e promove a síntese de TIMP; a redução da síntese de MMP levará a uma degradação insuficiente do ECM, resultando na acumulação de ECM. Foi demonstrado que vários receptores anti-TGF-β são eficazes em modelos animais. Os inibidores da protease serina podem bloquear a activação de TGF-β; o factor de transferência de Smad-7 pode bloquear a via de sinalização intracelular de TGF-β; e o nosso estudo também demonstrou que a interferência na expressão de Smad-2 na via de transmissão de TGF-β pelo RNA inibe a activação de TGF-β no HSC . O receptor gama do activador proliferador peroxisómico (PPAR-γ) controla o crescimento e diferenciação celular, e os tiazolidinadiones actuam como ligandos PPAR-γ para inibir a activação HSC e promover a fibrinólise. Captopril (inibidor da enzima de conversão da angiotensina) e candesartan (antagonista dos receptores da angiotensina II) podem também reduzir a extensão da fibrose hepática actuando sobre a HSC e promovendo a fibrinólise. 1.1.2 Inibição da proliferação de HSC Factor de crescimento derivado de placas (PDGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento fibroblasto, semelhante à insulina O factor de crescimento (IGF-I) pode promover a proliferação da HSC através de vias de sinalização do receptor de tirosina quinase em lesões hepáticas agudas e crónicas. O PDGF é particularmente importante, e o inibidor da fosfodiesterase 3-7-dimetilxantina bloqueia a mitose HSC relacionada com o PDGF. As propriedades anti-angiogénicas do trinitrofenilo (TNP-470) também podem inibir a proliferação do HSC. Em contraste, espera-se que pequenos inibidores dos receptores de tirosina quinase sejam utilizados no tratamento da fibrose hepática através de modificações posteriores. 1.1.3 Indução da apoptose de HSC A reversão espontânea da fibrose hepática depende principalmente da apoptose de HSC, o que reduz o número de HSC, diminui a secreção de ECM, diminui a síntese de TIMPs, aumenta a actividade de MMPs e aumenta a degradação de ECM, promovendo assim a reversão da fibrose hepática. A via receptora da morte, a via mitocondrial e a via do retículo endoplasmático são as vias mais importantes de mediação da apoptose HSC. HSC expressa muitos receptores de morte superficial celular, tais como Fas ligand, TNF-α e factor de crescimento nervoso (NGF), que podem actuar sobre os receptores correspondentes para induzir apoptose HSC in vitro; o diazepam promove a apoptose HSC actuando sobre o receptor periférico de benzodiazepina (PBR) no poro mitocondrial; a micoproteína ramificada e a salazosulfapiridina promovem a apoptose HSC inibindo o factor de transcrição nuclear (NF-κB) para promover a apoptose HSC. 1.2 Promoção da degradação da matriz extracelular O desequilíbrio entre a síntese e a degradação do ECM, a remodelação da matriz e o aumento anormal da deposição dos componentes intersticiais do colagénio, tais como o colagénio tipo I/III, são a base patológica da fibrose hepática. Portanto, aumentar a expressão genética das colagenases, regular a actividade biológica das colagenases endógenas e degradar o aumento do ECM é a chave para inverter o processo de fibrose hepática. As MMPs são um grupo de enzimas proteolíticas que desempenham um papel chave na degradação da ECM, e a sua actividade está estreitamente relacionada com a expressão dos seus inibidores específicos, TIMPs, nos tecidos. Actualmente, as MMPs e TIMPs tornaram-se alvos importantes para a terapia genética da fibrose hepática, e a família das MMPs inclui quatro grupos principais, nomeadamente colagenases mesenquimais, gelatinases, mesolisinas e MMPs tipo membrana (MT-MMPs), dependendo do substrato. Os TIMPs identificados até agora incluem TIMP-1, -2, -3 e -4, todos eles podem ligar-se a MMPs activos específicos num complexo 1:1 e inibir a actividade de degradação destes últimos contra ECM. Verificou-se que a transfecção de ratos de fibrose hepática com plasmídeos que expressam MMPs ou plasmídeos oligonucleótidos antisensos de TIMPs promoveu a degradação do colagénio de tipo I/III e a fibrose invertida; a hormona reprodutiva relaxina (relaxin) também reduziu a deposição de colagénio devido à activação de HSC através da desregulação de TIMPs; os inibidores de prolina-4-hidroxilase inibiram a acção das TIMPs e relativamente Os inibidores da prolina-4-hidroxilase podem aumentar a actividade das MMPs inibindo as TIMPs, promovendo assim a degradação das MMPs e invertendo a fibrose hepática. O activador do plasminogénio uroquinase (uPA) é o iniciador da cascata de proteína de clivagem ECM. uPA também aumenta a expressão do factor de crescimento de hepatócitos (HGF) e upregula a actividade do MMP, promovendo a reversão da fibrose hepática e a regeneração de hepatócitos. 2. aplicação da tecnologia vectorial na terapia genética para fibrose hepática A transferência genética eficaz é a chave para a terapia genética, e é importante escolher o vector certo para maximizar a eficácia da citocina nas células alvo. O vector ideal deve ter as vantagens de alta especificidade, alta afinidade, alta capacidade genética, alta eficiência de integração e transfecção, baixa antigenicidade e toxicidade, e longa duração da expressão dos genes funcionais. Os vectores genéticos estão divididos em duas categorias: vectores virais e vectores não-virais. Os vectores não virais incluem ADN encapsulado em lipossoma, poliplexos (complexos polilisina, etc.) e restos celíacos recombinantes. Os vectores não virais têm as vantagens de uma grande capacidade de transporte de genes, menos antigenicidade e menos toxicidade, mas ao mesmo tempo têm as desvantagens da baixa eficiência e da curta duração da expressão dos genes funcionais, pelo que os vectores virais representam actualmente mais de 70% de todos os vectores estudados e utilizados. Actualmente, os vectores virais são considerados como as ferramentas mais eficazes para a transferência genética, e os retrovírus, adenovírus e vírus associados ao adeno (AAV) são os vectores mais promissores para a terapia genética da fibrose hepática. O vector adenovírus é uma molécula de ADN de dupla cadeia, que determina a sua estabilidade física e química como a característica mais importante. Os vectores adenovirais podem infectar tanto células divisoras como não divisoras, e a expressão do produto genético alvo pelo adenovírus pode ser suficientemente elevada para atingir níveis terapêuticos. Qi et al. construíram um vector adenoviral deficiente em replicação que expressa a região extracelular do receptor TGF-β tipo II para bloquear a via de sinalização endógena do receptor TGF-β; Rederfeld et al. introduziram um mutante de MMP-9 no BALB/c induzido por CCl4 ratos para se ligarem ao TIMP-1 para conseguirem derrubar o TIMP-1; Salgado et al. construíram um gene uPA humano não-secretório mediado por adenovírus defeituoso para induzir a expressão da colagenase. Contudo, os vectores adenovirais têm a desvantagem da curta duração da expressão do gene alvo, e como os adenovirais são imunogénicos, são susceptíveis de causar reacções imunitárias e efeitos secundários tóxicos no hospedeiro. AAV é um vírus de DNA de cadeia única, não patogénico, que pode ser integrado no cromossoma 19 e pode ser infectado virulentamente com a ajuda de um vírus ajudante. AAV tem sido utilizada para a expressão de IFN-γ humano (hIFN-γ), que inibe a activação de HSC, e Tsui et al. utilizaram o gene da heme oxigenase tipo I mediada por AAV (HO-1) num modelo animal de fibrose hepática por injecção de veia porta e obtiveram eficiência de transfecção satisfatória e expressão estável. Os retrovírus são vírus RNA envolvidos e podem ser divididos em duas categorias de acordo com a sua estrutura genómica: retrovírus simples como o vírus da leucemia do rato (MLV) e retrovírus mais complexos como o vírus da imunodeficiência humana (HIV) no género lentivírus (LV), HIV). Os retrovírus simples foram utilizados pela primeira vez na terapia genética para a fibrose hepática. Uma vez que só pode transferir genes exógenos para a proliferação de células divisórias e é ineficaz na transcrição de células quiescentes, os autores anteriores tiveram de utilizar meios prejudiciais como a hepatectomia parcial para induzir a divisão hepática, e as desvantagens da fraca estabilidade das partículas virais, a pequena quantidade de genes exógenos que possuem, e a sua vulnerabilidade à rápida destruição por complementação limitaram a sua utilização. Lentiviruses são membros da família Retroviridae. Os principais lentivírus isolados até à data são: VIH, vírus da anemia infecciosa da eqina (EIAV) e o vírus da imunodeficiência do símio (SIV). Ao contrário de outros retrovírus, o genoma lentiviral é complexo e contém três genes estruturais, gag, pol e env, bem como as estruturas LTR de 5′ e 3′ terminais, e quatro genes auxiliares, vif, vpr, nef e vpu, e dois genes reguladores, tat e rev. As células animais infectadas ou transformadas podem ser transmitidas continuamente, pelo que os lentivírus podem ser utilizados como vectores para alterar o genótipo das células animais e transmiti-lo aos descendentes. A característica mais importante dos vectores lentivíricos é que podem infectar células divisoras bem como células não divisoras, e podem ser expressas no hospedeiro durante muito tempo, e são menos susceptíveis de induzir uma resposta imunitária no hospedeiro, tornando-as seguras. Além disso, o lentivírus é adequado para múltiplos sistemas de expressão genética devido à sua poderosa capacidade de embalagem, que é geralmente considerada até 8-10 kb. Várias experiências em modelos animais mostraram que os hepatócitos são susceptíveis à transferência de genes mediados pelo LV e que os genes exógenos transferidos podem ser expressos durante muito tempo. zahler et al. descobriram que a eficiência da infecção pelo LV pode atingir 30-40% nos hepatócitos fetais de cultura primária. O LV foi modificado para transduzir eficazmente os hepatócitos de cultura primária de ratos e os hepatócitos humanos de cultura primária in vitro. Construímos um plasmídeo de interferência de RNA do gene tTG mediado por lentivírus para transfectar HSC de ratos primários e obtivemos uma expressão estável. Com base nas suas boas propriedades na transdução do gene hepatocitário, a aplicação de vectores lentivíricos na terapia genética para a fibrose hepática tem atraído cada vez mais atenção e a sua segurança está gradualmente a ser assegurada através da melhoria contínua. 2.2 A selecção de vectores-alvo específicos do fígado está a ganhar atenção, uma vez que os tecidos e órgãos extra-hepáticos também podem ter alvos, pelo que a ênfase na especificidade e na focalização do efeito terapêutico não só melhora a eficácia da acção como também reduz a toxicidade potencial para outros órgãos. Inagaki et al. descobriram que ao adicionar a sequência melhoradora COL1A2 ao promotor vectorial, o gene exógeno só foi expresso no grupo da fibrose hepática de ratos com o melhorador específico. O gene exógeno só foi expresso em HSC activado de ratos com fibrose hepática, mas não no fígado ou outros órgãos de ratos normais. Por conseguinte, o rastreio adicional de vectores altamente selectivos contra o parênquima hepático e células mesenquimais para a terapia genética da fibrose hepática melhorará a orientação e eficiência do tratamento da fibrose hepática e aumentará o nível global do tratamento anti-fígado da fibrose hepática. Em conclusão, com a crescente compreensão dos mecanismos moleculares da fibrose hepática, a terapia genética para a fibrose hepática tem mostrado boas perspectivas de desenvolvimento; do mesmo modo, o desenvolvimento da tecnologia dos vectores tem também proporcionado uma garantia para melhorar a orientação, segurança e eficácia da terapia genética para a fibrose hepática. No entanto, a fibrose hepática é regulada por múltiplos genes e vias, e a maior parte da terapia genética está actualmente limitada a estudos com animais. Por conseguinte, há um longo caminho a percorrer na investigação da terapia genética para a fibrose hepática, e a utilização da terapia genética combinada multi-ligada e a melhoria da orientação e segurança dos sistemas vectoriais são direcções importantes para o desenvolvimento da terapia genética para a fibrose hepática.