Existem grupos de células estaminais em tecidos continuamente renováveis do corpo como a medula óssea, pele e epitélio da mucosa intestinal, onde as células maduras são geradas através da proliferação e diferenciação ininterrupta de células estaminais. No fígado, a existência de células estaminais no tecido hepático há muito que é uma questão controversa, uma vez que os hepatócitos maduros ainda têm a capacidade de dividir e proliferar. Nos últimos anos, com rápidos avanços na biologia do desenvolvimento, particularmente na biologia das células estaminais, a existência de células estaminais hepáticas e o seu significado no desenvolvimento de doenças hepáticas tem recebido cada vez mais atenção. Uma variedade de processos fisiopatológicos no fígado pode estar intimamente relacionada com a proliferação anormal e diferenciação das células estaminais; e o estudo aprofundado das células estaminais do fígado mostrou perspectivas atractivas para o tratamento de várias doenças hepáticas agudas e crónicas, bem como do carcinoma hepatocelular. A compreensão das células estaminais hepáticas e a investigação relacionada em torno desta célula estaminal especial tornou-se um dos pontos quentes da biologia moderna das células estaminais e da medicina clínica. Zhang Zhigao, Departamento de Gastroenterologia, Hospital Geral da Região Militar de Jinan
1 Conceito de células estaminais hepáticas
1.1 Células estaminais embrionárias do fígado No início do desenvolvimento embrionário humano, o divertículo hepático no fim do antebraço evolui em duas partes, o fígado e a cauda, das quais o fígado cresce extremamente rápido e preenche a grande parte da cavidade abdominal até à quinta semana de desenvolvimento embrionário [1]. Estes hepatócitos embrionários em evolução hepática são chamados hepatoblastos, que não só têm uma forte capacidade proliferativa, como também têm o potencial de se diferenciarem em hepatócitos e células do canal biliar [2], pelo que os hepatoblastos são na realidade células estaminais hepáticas embrionárias. Apenas o terminal do foregut pode ser induzido em hepatócitos durante o desenvolvimento embrionário. quatro famílias de factores de transcrição desempenham um papel importante na expressão de genes específicos de diferenciação em hepatócitos: (i) vários factores nucleares hepatócitos 1 (HNF1) com o mesmo domínio estrutural; (ii) uma série de proteínas de factor nuclear hepatócito 3 (HNF3); (iii) uma superfamília receptora nuclear. (iv) a família dos zíperes leucinos (C/EBP). As células alvo são reguladas pelos factores de transcrição acima referidos para produzir alterações fenotípicas através da expressão de genes específicos.
Os marcadores celulares de células estaminais hepáticas embrionárias incluem marcadores de diferenciação tais como albumina (ALB), alfa-fetoproteína (AFP) e uma série de citoceratinas (CK7, 8, 9, 14, 18, 19, 20), factores e receptores de células estaminais relacionados tais como Thy1, Flt3, SCF/ckit, OV6, e marcadores de células estaminais derivadas de mielóide tais como CD34 (Tabela 1). et al [3] isoladas e cultivadas com sucesso células estaminais embrionárias hepáticas baseadas nos marcadores celulares acima referidos utilizando a classificação citométrica de fluxo (FACS), e as células estaminais hepáticas embrionárias isoladas poderiam diferenciar-se em hepatócitos e células epiteliais do ducto biliar quando transplantadas para o fígado de animais homólogos, indicando que as células estaminais hepáticas embrionárias têm um potencial de diferenciação multidireccional.
1.2 Células estaminais do fígado adultas A presença de células estaminais no fígado normal é controversa. Tem sido sugerido que o próprio fígado é um “pool de células estaminais” com base no facto de os hepatócitos maduros poderem recuperar a sua capacidade de proliferar sem interrupção após uma lesão hepática. Contudo, de acordo com a definição de células estaminais, para além da capacidade de dividir e proliferar, as células estaminais também devem ter um certo grau de potencial de diferenciação. Os descendentes de hepatócitos maduros que se dividem são ainda hepatócitos maduros e por isso, no sentido mais estrito, os hepatócitos maduros não devem ser considerados como células estaminais.
Pensa-se agora que as células epiteliais com potencial de diferenciação bidireccional estão presentes na região terminal da árvore biliar, o equivalente histológico dos canais de Hering, e podem ser células mesenquimais “não-descritas” de menor tamanho derivadas do pericôndrio. Na presença de danos hepáticos graves e/ou proliferação deficiente de hepatócitos maduros, podem activar-se e proliferar anormalmente, aparecendo em grande número nas áreas periféricas dos lóbulos hepáticos e aparecendo histologicamente como pequenas populações de células em redor dos lóbulos, proliferando activamente. Estas células têm uma grande proporção nucleoplasmática e núcleos redondos ou ovóides e são conhecidas como células ovais hepáticas (HOC). As células ovais proliferantes migram ao longo do parênquima hepático em direcção à região central dos lóbulos hepáticos, onde se diferenciam em hepatócitos maduros para reparar e reconstruir o fígado. Ao mesmo tempo, as células ovais podem também diferenciar-se em células epiteliais dos canais biliares e participar na formação de canais biliares intra-hepáticos. É agora geralmente aceite que as células ovais hepáticas são as células estaminais dentro do tecido hepático adulto. Outra prova importante de que as células ovais são consideradas células estaminais hepáticas é que partilham marcadores celulares semelhantes com células estaminais hepáticas embrionárias, ou seja, hepatócitos adultos, e partilham alguns antigénios de superfície com células estaminais hematopoiéticas (Quadro 1).
Existem dois pré-requisitos para a indução da proliferação maciça de oócitos hepáticos adultos: um, a presença de factores que estimulam a regeneração do tecido hepático, comummente utilizados em modelos animais onde a maioria das hepatectomias ou tóxicos (por exemplo, tetracloreto de carbono) provocam a necrose hepática; e dois, a inibição da proliferação de hepatócitos normais, sendo os fármacos utilizados em experiências com animais para inibir a divisão de hepatócitos maduros o 2acetylaminofluoreno ( 2acetylaminofluoreno (2AAF), fumonisina B1 (FB1), retrorsina ou dietas contendo etionina colinata (CDE) têm sido utilizadas em estudos com animais para inibir a divisão de hepatócitos maduros.
As células estaminais não desempenham a função de células diferenciadas; a sua função é a de produzir células diferenciadas maduras por proliferação. As células-filhas produzidas pela divisão das células estaminais só podem escolher um de dois caminhos: ou mantêm as suas características parentais e permanecem células estaminais, ou seguem um caminho específico para a diferenciação terminal. Quadro 1 Marcadores celulares para hepatócitos adultos, células ovais, hepatócitos, células epiteliais do ducto biliar e células hepatocitárias Nota: +: positivo; -: negativo; ? 1.3 Multipotência e plasticidade das células estaminais hepáticas Nos últimos anos, a descoberta de células progenitoras adultas multipotentes (MAPC) em indivíduos adultos tem sido uma área particularmente excitante da investigação de células estaminais. As células estaminais do fígado podem ser derivadas do próprio fígado, mas estudos humanos e animais demonstraram que as células estaminais não derivadas do fígado podem diferenciar-se em células estaminais do fígado e mesmo em hepatócitos maduros. As células progenitoras multipotenciais da medula óssea isoladas podem ser induzidas a produzir células estaminais hepáticas fenotípicas distintas e hepatócitos, adicionando factores específicos de crescimento durante a cultura in vitro [4]. Vários estudos demonstraram que podem ser encontrados hepatócitos com marcadores genéticos de dadores no tecido hepático de pacientes e modelos animais submetidos a transplante de medula óssea. Foi também relatada a diferenciação horizontal de diferentes tipos de células estaminais intertecidos, por exemplo Dabeva (1997) descobriu que as células epiteliais isoladas do tecido pancreático de ratos poderiam também diferenciar-se em hepatócitos após transplante para o fígado de ratos consanguíneos, onde poderiam integrar-se em estruturas lobulares hepáticas e exprimir proteínas específicas de hepatócitos. Não é claro em que capacidade as células progenitoras derivadas da medula óssea viajam através da corrente sanguínea até ao fígado. Dados de investigação sugerem que os principais componentes celulares da medula óssea são células estaminais hematopoiéticas (HSCs), células estaminais mesenquimais (MSCs) e progenitores de células endoteliais. Experiências actuais in vitro e in vivo demonstraram que tanto as células estaminais hematopoiéticas (HSCs) [5] como as células estaminais mesenquimais da medula óssea (MSCs) [6] podem diferenciar-se em hepatócitos. O facto de os oócitos hepáticos transportarem marcadores de células estaminais da medula óssea como CD34, Thy1, Fly3, SCF/ckit ainda não sugere que esteja de alguma forma necessariamente ligado a células estaminais hematopoiéticas. Não é claro se os progenitores multipotentes na medula óssea adquiriram a capacidade de transdiferenciação num microambiente diferente ou se eles próprios são progenitores potenciais multiplicadores diferenciados mais primitivos.
Os oócitos hepáticos são de plástico. Os oócitos podem diferenciar-se em células epiteliais do tracto gastrointestinal e células pancreáticas com funções endócrinas [7]; no tecido cerebral, os oócitos podem diferenciar-se em células neuronais e gliais [8]; no coração, as células estaminais hepáticas podem diferenciar-se em cardiomiócitos [9]; Asakura [10] descobriu que as células estaminais de vários órgãos, incluindo o fígado, podem diferenciar-se em hematopoiéticas da medula óssea Murase [11] descobriu que o transplante de fígado sozinho em ratos letais irradiados poderia restabelecer a hematopoiese da medula óssea, com exactamente o mesmo efeito de salvamento que o transplante de medula óssea. Em pacientes tratados com transplante de fígado, o linfoma de células B encontrado no fígado transplantado subsequente foi relatado como sendo de origem doadora (células tumorais com marcadores genéticos do doador) [12]; a Universidade de Hong Kong relatou que o sarcoma mesenquimatoso encontrado no fígado transplantado de um paciente semelhante era também de origem doadora [13]. doença do enxerto (GVHD), um grande número de linfócitos derivados de dadores imunologicamente activos pode ser encontrado quimicamente no hospedeiro. A origem celular destes linfócitos e células mesenquimais anormalmente proliferantes do fígado doador pode ser dupla: em primeiro lugar, algumas células estaminais hematopoiéticas permanecem após o fígado doador ter sido isolado apesar da perfusão hepática completa, e têm origem em células estaminais hematopoiéticas residuais no fígado doador; em segundo lugar, se as células estaminais hepáticas forem suficientemente plásticas, podem também ter origem em células progenitoras multipotentes no fígado doador.
2 Células estaminais do fígado e doença hepática
2.1 Células estaminais hepáticas e lesão hepática aguda A resposta regenerativa à lesão hepática ocorre muito rapidamente e de forma abrangente (todos os hepatócitos residuais entram num estado proliferativo) e é controlada por mecanismos reguladores precisos (efeitos sinérgicos de vários factores de crescimento, citocinas e hormonas), ao mesmo tempo que desempenham as suas funções fisiológicas normais (por exemplo, desintoxicação, secreção biliar, síntese de glicogénio, etc.). Experiências com animais e estudos clínicos demonstraram que a regeneração do tecido hepático induzida por lesões hepáticas agudas é realizada principalmente pela reentrada dos restantes hepatócitos normais no ciclo celular. Teoricamente, em ratos com hepatectomia de 2/3, os hepatócitos residuais podem regenerar o tecido hepático após uma média de 3/2 ciclos celulares, e todo o processo de regeneração pode ser completado em 1~2 semanas. A necrose hepática resultante de hepatectomia parcial e hepatite aguda no ambiente clínico pode sofrer um processo de regeneração semelhante ao do modelo animal.
Se a divisão e proliferação de hepatócitos maduros for inibida, ou se a extensão da necrose hepática for demasiado grande, a regeneração do fígado terá de ser conseguida através da mobilização da proliferação de células estaminais. No modelo experimental de regeneração hepática, observa-se claramente que as células ovais proliferam primeiro em grande número em torno dos lóbulos hepáticos e migram gradualmente para os lóbulos ao longo do tempo. Clinicamente, as observações histológicas de necrose hepática maciça aguda também revelam que as células ovais aparecem pela primeira vez na região da placa delimitadora à volta dos lóbulos, e aproximadamente no quarto dia de lesão hepática, as células ovais transformam-se em hepatócitos.
2.2 Células estaminais hepáticas e hepatite viral crónica Na prática clínica, a lesão e regeneração aguda do tecido hepático não é, na realidade, muito comum; o problema com que nos deparamos frequentemente é a lesão hepatocelular recorrente e persistente causada pela hepatite crónica e a proliferação compensatória de hepatócitos neste estado.
Dentro do hepatócito, o vírus HBV completa a sua própria replicação ou mesmo integra-se especificamente com o genoma do hepatócito. Ao mesmo tempo, os genes virais utilizam o aparelho de síntese de proteínas do hepatócito para montar proteínas específicas do vírus. A proteína viral é processada no hepatócito como um antigénio endógeno e depois ligada a moléculas do tipo MHCI e entregue à superfície do hepatócito, onde é especificamente reconhecida pelo CTL ou morta pelo sistema Fas. Se o vírus for eliminado pelo corpo através de mecanismos imunitários eficazes, os hepatócitos já não são destruídos e o corpo recupera após a regeneração compensatória estar completa. No entanto, a hepatite B (ou C) caracteriza-se pela dificuldade de depuração viral, danos hepáticos recorrentes e persistentes e regeneração, especialmente nas fases finais da infecção, quando os hepatócitos maduros são extensamente infectados pelo vírus e os hepatócitos infectados pelo vírus perdem frequentemente a sua capacidade de proliferação (a histoquímica mostra que as células com antigénios virais positivos raramente apresentam uma coloração positiva para o PCNA), e a diferenciação proliferativa das células estaminais torna-se a principal compensação proliferativa população celular. Estudos experimentais também confirmaram que em pacientes com cirrose hepática, a histopatologia revela um estado proliferativo de células estaminais em torno de focos de hiperplasia [15].
As células estaminais hepáticas encontram-se principalmente nos canais biliares terminais e uma das características histológicas da hepatite crónica (hepatite especialmente activa) é a presença de proliferação maciça dos canais biliares na área confluente e nos seus intervalos de tecido conjuntivo fibroso circundante. Embora o mecanismo da fibrose hepática na hepatite crónica ainda não seja compreendido, parece haver uma ligação definitiva entre o desenvolvimento da fibrose e a proliferação de células estaminais hepáticas, e níveis elevados de AFP séricos nos pacientes podem também estar associados à proliferação anormal de células estaminais.
2.3 Células estaminais hepáticas e carcinoma hepatocelular primário A Oncologia está actualmente a debater se o carcinoma hepatocelular resulta da diferenciação de hepatócitos maduros (desdiferenciação) ou da paragem da maturação da diferenciação ou desdiferenciação de células estaminais (disdiferenciação). A visão da disdiferenciação está dividida.
A visão da disdiferenciação sugere que o alvo da acção do carcinogéneo é o hepatócito maduro, causando mutações e/ou desestabilização do material genético da célula alvo. As provas experimentais em apoio desta teoria incluem a rotulagem de hepatócitos maduros com transfecção genética mediada por retrovírus e que as lesões pré-cancerosas podem ter origem em hepatócitos maduros num modelo de carcinoma hepatocelular induzido por 2acetylaminofluorene (2AAF). Para o carcinoma hepatocelular humano, a hipótese de desdiferenciação de hepatócitos maduros parece ser uma visão geralmente aceite. A investigação actual na biologia molecular do carcinoma hepatocelular humano gira em torno do rastreio dos genes associados ao tumor e da mutação ou instabilidade do genoma hepatocitário que pode ser causada pela integração do genoma viral.
A hipótese de diferenciação bloqueada sugere que o alvo da acção carcinogénica é o microambiente em que as células estaminais se diferenciam e amadurecem, e que vários factores que levam a anomalias estruturais e/ou químicas do mensageiro neste microambiente são a causa primária da acção carcinogénica, sendo a essência do tumor proveniente da diferenciação bloqueada das células estaminais pré-existentes no tecido [16]. No nosso estudo, descobrimos também que o tecido da hepatite crónica, o tecido cirrótico e o tecido paracanceroso do fígado podem exprimir níveis elevados de produtos proteicos do vírus da hepatite B, mas no tecido canceroso, a expressão dos antigénios virais desaparece misteriosamente, e os hepatócitos infectados pelo vírus perdem frequentemente a sua actividade proliferativa (PCNA negativo), e as células proliferantes são frequentemente “células ovais” mais pequenas à volta dos lóbulos hepáticos As células em proliferação são frequentemente “células ovais” mais pequenas à volta dos lóbulos hepáticos, ou seja, células estaminais dentro do tecido hepático.
Outras evidências que apoiam a teoria da diferenciação deficiente incluem a presença de células ovais nos tecidos malignos hepáticos [17]; as células do carcinoma hepatocelular e as células ovais expressam marcadores celulares semelhantes, tais como AFP, GGP, a série de citoqueratina CK (7, 8, 18, 19, 20), factores de transcrição OC2 e OC3, marcadores ovais de células OV1 e OV6, marcadores de células estaminais SCF/ckit e CD34; vários estudos descobriram que as células do carcinoma hepatocelular também expressam antigénios de diferenciação de células B, tais como CD10 e CD40, mas se este antigénio é expresso em oócitos e hepatócitos adultos não foi relatado; actividade telomerase tanto nas células estaminais como nas células cancerosas; baixa ou nenhuma replicação de vírus e baixa ou nenhuma expressão de antigénios virais nas células do carcinoma hepatocelular; a questão da origem multicêntrica do carcinoma hepatocelular; linhas de células do carcinoma hepatocelular cultivadas in vitro com propriedades de diferenciação heterogéneas e bidireccionais. Embora a hipótese de diferenciação prejudicada das células estaminais tenha sido proposta por vários autores, até à data não existem provas visuais de que as células cancerígenas do fígado sejam derivadas de células estaminais pré-existentes in vivo.
3 Perspectivas para aplicações em células estaminais hepáticas
A investigação sobre células estaminais do fígado ainda está na sua infância, e as técnicas de isolamento, cultura e identificação de células estaminais do fígado ainda estão imaturas. A relação entre as células estaminais do fígado e a patologia crónica do fígado e o cancro do fígado ainda está por esclarecer, e os mecanismos que regulam a diferenciação multiorigem e multidireccional das células estaminais do fígado adultas ainda estão por esclarecer.
3.1 Células estaminais hepáticas e reconstituição hepática A necrose hepatocelular aguda e subaguda de várias causas pode ser salva pelo transplante de células estaminais do fígado humano se a arquitectura básica do fígado ainda estiver intacta, tirando partido da proliferação infinita de células estaminais hepáticas e do seu potencial para se diferenciarem em hepatócitos e células do ducto biliar.
As doenças do fígado geneticamente defeituosas humanas como a hepatomegalia têm potencial para serem tratadas de forma semelhante ou melhor do que o transplante de fígado através do transplante de células estaminais hepáticas. Dez anos antes Rhim et al. relataram que o transplante de hepatócitos genotípicos normais de ratos adultos em ratos transgénicos de albumina uroquinase (AlbuPA) poderia corrigir a função hepática defeituosa dos ratos transgénicos, mostrando a proliferação de hepatócitos livres de AlbuPA, que acabou por substituir os hepatócitos geneticamente defeituosos. No ano seguinte, o mesmo autor relatou um transplante bem sucedido de hepatócitos de rato em ratos transgénicos AlbuPA imuno-tolerantes, com 100% de substituição de hepatócitos de rato geneticamente defeituosos por hepatócitos de rato. Em contraste, Overturf usou um modelo animal de ratos com deficiência genética de fumarylacetoacetate hydrolase (FAH), que desenvolvem tirosinemia hereditária tipo I (HT1) doença hepática degenerativa, e usou hepatócitos normais Descobriu que apenas eram necessários 1000 hepatócitos para substituir em grande parte os hepatócitos defeituosos originais, e concluiu que os hepatócitos têm um potencial proliferativo semelhante ao das células estaminais hematopoiéticas. Contudo, é geralmente aceite que os hepatócitos diferenciados têm um potencial proliferativo limitado após a implantação, têm uma única direcção de diferenciação, e os hepatócitos maduros são muito maiores do que as células estaminais e não se dispersam facilmente no parênquima hepático após a injecção da veia porta, pelo que o transplante de células estaminais deve continuar a ser favorecido. Na prática clínica, Kumar et al [18] relataram um caso de insuficiência hepática devido a amiloidose primária que ainda se repetiu após o transplante hepático e foi curada através da realização de transplantes de células estaminais 10 e 14 meses após o transplante hepático.
3.2 Tratamento das células estaminais hepáticas e do carcinoma hepatocelular Como mencionado anteriormente, o carcinoma hepatocelular pode ocorrer como resultado de uma diferenciação bloqueada das células estaminais hepáticas, pelo que o tratamento pode ser alcançado através da melhoria do microambiente do fígado para induzir a diferenciação das células cancerosas em células normais, ou através da indução da apoptose das células cancerosas. Já há 10 anos, Coleman [19] relatou que as linhas celulares alogénicas de carcinoma hepatocelular GN6TF e GP7TB, malignamente transformadas da linha de células estaminais do fígado de ratos WBF344, foram transplantadas para o fígado de ratos homozigotos, resultando no não desenvolvimento de tumores no GN6TF e na integração de células cancerosas no parênquima hepático para formar uma placa hepática normal; enquanto a GP7TB permaneceu tumorrigénica no fígado, mas o tumor foi bem diferenciado em termos de histomorfologia . A conclusão é que o microambiente do tecido hepático pode influenciar a diferenciação das células cancerosas e eliminar ou reduzir o potencial maligno das células tumorais. Foram relatadas várias experiências sobre a indução da diferenciação das linhas celulares do carcinoma hepatocelular a um fenótipo hepatocelular maduro in vitro, mas os mecanismos moleculares de indução da diferenciação e as perspectivas de aplicação clínica estão ainda por investigar mais profundamente.
3.3 Células estaminais hepáticas e terapia genética A terapia genética é o tratamento mais promissor para doenças genéticas defeituosas e mesmo malignas, sem rejeição imunológica e sem a necessidade de os pacientes tomarem medicamentos imunossupressores a longo prazo. Dadas as limitações da cultura in vitro de hepatócitos maduros, é mais difícil introduzir genes exógenos nos hepatócitos, enquanto que é mais fácil utilizar células estaminais. Espera-se que as células estaminais do fígado geneticamente modificadas ou as células estaminais da medula óssea corrijam deficiências metabólicas no fígado, desde que o microambiente em que as células do fígado hospedeiro crescem seja favorável, e que o transplante autólogo dessas células estaminais geneticamente modificadas demonstre uma boa promessa.