Objectivo: Estudar o efeito do factor de crescimento básico do fibroblasto (bFGF) e do seu anticorpo receptor na ultraestrutura das células epiteliais das lentes humanas (HLECs). MÉTODOS: A microscopia electrónica de transmissão foi utilizada para observar as alterações ultra-estruturais de HLEC normais e bFGF após a acção de bFGF e do anticorpo receptor que bloqueia a acção de bFGF em HLECs. Resultados: Os HLEC normais tinham mais mitocôndrias, retículos endoplasmáticos rugosos, ribossomas livres e alguns microfilamentos, com uma membrana nuclear intacta e cromatina homogénea. A acção de bFGF mostrou uma membrana celular intacta com mais saliências locais, mais mitocôndrias e ribossomas livres, uma matriz mais densa, mais microfilamentos perto do núcleo, uma membrana nuclear intacta, cromatina homogénea e um nucleolus alargado. bFGF anticorpo receptor Após o bloqueio, as saliências celulares desapareceram, a membrana celular foi obviamente destruída, um grande número de mitocôndrias foi cavitado, a cristae desapareceu, a matriz foi reduzida e degenerada de forma nublada, o retículo endoplasmático foi obviamente reduzido a desaparecer, a membrana nuclear foi obviamente destruída, e algumas células tinham estruturas pouco claras e tinham tendência a morrer. Conclusão: O efeito pró-proliferativo do bFGF em HLEC pode ser bloqueado por anticorpos para o receptor FGF. O desenvolvimento da opacificação da cápsula posterior está associado à proliferação, migração e fibrose das células epiteliais da lente pós-operatória. As alterações da cápsula posterior da lente estão intimamente relacionadas com o papel dos factores de crescimento, especialmente o receptor básico do factor de crescimento do fibroblasto (bFGF). O bloqueio do receptor FGF inibe o efeito proliferativo do bFGF sobre os HLEC [1], e investigámos as alterações na ultraestrutura celular causadas pela sua acção. 1, Materiais e métodos 1.1, Cultura de células epiteliais de lentes fetais Fresh 2 globos oculares do mesmo feto, enxaguados bem com soro fisiológico, depois enxaguados com gentamicina, colocados num material de vidro limpo, limpos de tecido periocular, e a conjuntiva cortada. Os globos oculares tratados foram bem lavados com solução de gentamicina diluída, colocados noutra incubadora de vidro limpo, e a esclera foi cortada num padrão circular a cerca de 4 cm do limbo córneo num banco ultra limpo, a parte superior removida (a córnea foi utilizada para cultura de células epiteliais córneas) e a lente removida. A cápsula anterior foi separada ao longo da porção equatorial da lente e colocada num prato de plástico de 27 mm de diâmetro com o lado celular virado para o fundo, adicionaram-se algumas gotas de 150 g/L de solução de cultura DMEM (pH 7,2), e a cápsula foi cortada em tantos pedaços quanto possível com uma tesoura de íris, espalhada e dispersa e colocada numa câmara de CO2 (MCO17AI, SANTO, Japão) durante aproximadamente 4 h. Posteriormente, a solução de cultura foi suavemente reabastecida em aproximadamente 2,5 mL. A cultura continuou (as condições de cultura eram 37°C, 50mL/L CO2, temperatura de saturação. O crescimento celular foi observado diariamente sob o microscópio e o meio de cultura foi mudado em 7-10 d. Cultura de transfusão: quando o crescimento celular for fundido, aspirar o fluido de cultura, enxaguar duas vezes com solução de Hanks, adicionar 2,5g/L de solução de tripsina 1,5mL, digerir 4~8min aspirar, adicionar o fluido de cultura contendo 150g/L FCF DMEM sopro repetidamente para fazer as células suspensas, publicar uniformemente, depois dividir em vários pratos de cultura para continuar a cultura. 1.2 Preparação de espécimes de células As experiências foram realizadas utilizando 2 gerações de células. As lamelas cortadas em pequenos pedaços foram esterilizadas e colocadas num recipiente de cultura de vidro de 27mm de diâmetro. Células epiteliais de lente fetal, células adicionadas com bFGF (100μg/L) e suspensões celulares adicionadas com bFGF (100μg/L) e anticorpo receptor bFGF (5mg/L) foram largadas nas lamelas no recipiente de cultura para fazer 3 amostras diferentes e colocadas numa incubadora de CO2 para 4d. 1.3 Produção de espécimes por microscopia electrónica de transmissão Quando as lamelas estavam cheias de células, o meio de cultura foi descartado e enxaguado duas vezes com a solução de Hanks. As células foram raspadas com uma espátula de borracha, o sobrenadante foi removido após centrifugação, fixado com haptogaldeídos 30g/L, fixado com ácido de ósmio 10g/L, desidratado por etanol passo a passo, embebido por permeação com Epon812, polimerizado durante 72h numa incubadora 60℃, seccionado por máquina de seccionamento ultra-fino LKBB400, duplamente corado com acetato de uranilo e citrato de chumbo, observado e fotografado sob microscópio electrónico de transmissão por philips EM 400T. 2, Resultados 2.1, Células epiteliais da lente fetal As células epiteliais da lente fetal (2ª geração) mostraram mitocôndrias intracelulares normais, retículo endoplasmático rugoso, ribossomas livres e algumas estruturas de microfilamentos; a membrana nuclear estava intacta, a cromatina era uniforme e o número de organelas era limitado, sugerindo que as HLEC ainda são funcionais mas têm uma fraca capacidade proliferativa. 2.2 Células epiteliais da lente fetal com bFGF (100μg/L) A ultraestrutura das células epiteliais da lente fetal cultivadas com bFGF era a seguinte: a membrana celular estava intacta, com protuberâncias mais localizadas sob a forma de hastes ou dedos curtos; as organelas intracelulares eram abundantes, especialmente as mitocôndrias, que funcionavam bem, estavam significativamente aumentadas, e a matriz era densa. A membrana nuclear está intacta, a cromatina é espessa e uniforme, e o nucléolo é aumentado. O aumento de organelas indicou que a adição de bFGF teve um efeito pró-proliferativo sobre as células, resultando numa forte função metabólica e numa maior capacidade mitótica; ao mesmo tempo, indicou também que o bFGF teve um certo efeito de diferenciação sobre as células, tais como as estruturas de microfilamento dispostas ao longo do longo eixo, o que é uma característica típica após a diferenciação celular. 2.3 Quando bFGF (100μg/L) e o anticorpo receptor FGF (5mg/L) foram adicionados às células epiteliais da lente fetal, a ultraestrutura das células mostrou o desaparecimento das saliências celulares, destruição óbvia da membrana, vacuolação mitocondrial maciça, desaparecimento da cristae, redução da matriz e degeneração turva, redução óbvia ou mesmo desaparecimento do retículo endoplasmático, apenas alguns microfilamentos e uma ruptura As organelas celulares foram obviamente reduzidas e destruídas, algumas delas desapareceram; a membrana nuclear foi obviamente destruída; algumas células foram estruturalmente indistintas e até tenderam a morrer, sugerindo que os receptores bFGF foram antagonizados pelos anticorpos na experiência de neutralização de anticorpos, fazendo desaparecer o efeito do bFGF, e o metabolismo celular basicamente desapareceu e tendeu a morrer. O epitélio da lente é a única célula da lente que contém organelas mais abundantes, e o seu ambiente é também diferente de outras células epiteliais, que desempenham um papel importante na manutenção do metabolismo da lente. Enquanto as células epiteliais no centro da cápsula anterior são relativamente estáticas, as células epiteliais no equador proliferam e estendem-se para os pólos anterior e posterior da lente, diferenciando-se gradualmente em fibroblastos da lente e formando a estrutura multicamadas da lente, com alterações como o alongamento do corpo celular e a redução das organelas durante este processo. A literatura relata que a microscopia electrónica da lente mostra que a cápsula anterior e a cápsula equatorial estão firmemente ligadas às células da lente, enquanto que a cápsula posterior é mais fina e não tem estrutura celular. A presença de um grande número de micro-vibras no epitélio da lente expande a superfície das células, proporcionando um local para a troca de material entre esta parte da célula e o fluido atrial, acelerando assim o processo de troca de material entre as fibras da lente e o fluido atrial. As mitocôndrias, que são em forma de vara ou ovóide em células com bom funcionamento, são mais numerosas e podem tornar-se granulares ou aglomerar-se em aglomerados maiores quando estão em mau funcionamento ou metabolismo; microtubos e microfilamentos formam o esqueleto citoplasmático e, para além de apoiarem a morfologia celular e estarem relacionados com a motilidade celular, têm um impacto no movimento das membranas celulares como a fagocitose e as respostas imunitárias. Em geral, as células alongadas que se tornaram fibróticas respondem diferentemente ao bFGF, e o alongamento celular também se mostra consistente com a actividade de diferenciação fibrosa precoce. Quando ocorrem cataratas sob a cápsula posterior, o epitélio da lente periférica migra posteriormente para formar múltiplas camadas de células fragmentadas, inchadas e algumas células alongadas, quando o estroma abundante em forma de cápsula se acumula sob e entre as células, juntamente com alterações importantes no retículo endoplasmático rugoso, complexo de Golgi, microfilamentos e dobras aparentes da cápsula e células apoptóticas; isto tem alguma relevância para alterações semelhantes na turvação da cápsula posterior após a cirurgia da catarata . Em contraste, estudos recentes sobre a turvação capsular anterior produziram resultados semelhantes. Nesta experiência, a adição de bFGF resultou num aumento das organelas, indicando um efeito pró-proliferativo nas células, o que levou a uma forte função metabólica e ao aumento da capacidade mitótica. Nas mesmas condições, quando o bFGF foi adicionado juntamente com anticorpos ao receptor FGF, as organelas foram significativamente reduzidas e destruídas, algumas desapareceram, a membrana nuclear foi obviamente destruída, algumas células foram estruturalmente indistintas e até tenderam a morrer, sugerindo que o receptor bFGF foi antagonizado pelos anticorpos na experiência de neutralização de anticorpos, causando o efeito do bFGF a desaparecer, o metabolismo celular basicamente desapareceu e tendeu a morrer. O receptor do factor de crescimento do fibroblasto consiste numa região ligand extracelular, uma região transmembrana helicoidal e uma região intracelular. 48 isoformas receptoras podem ser geradas pelos quatro genes receptores FGF. A expressão fGFR1 diminui com a idade nas células epiteliais da lente, mas é reforçada pela acção do FGF e desempenha um papel importante no desenvolvimento e fibrose celular. O bloqueio do receptor FGF, seja de que forma for, inibe a proliferação de células da lente. A microscopia electrónica revelou provas experimentais de que a bFGF desempenha um papel importante na manutenção do suporte da membrana da cápsula das células epiteliais da lente. o efeito pró-proliferativo da bFGF nas células da lente é mediado pela sua ligação ao receptor FGF através do sistema de sinalização MAPK/ERK. a bFGF e o seu receptor desempenham um papel importante na proliferação e diferenciação das células epiteliais da lente. Os nossos resultados confirmam o efeito pró-proliferativo do bFGF sobre os HLEC e o facto de este efeito poder ser bloqueado por anticorpos ao seu receptor, e sugerem indirectamente que o bFGF exerce o seu efeito biológico através da ligação ao receptor na superfície da célula. Isto fornece uma base para experiências in vivo para elucidar o papel do bFGF e a teoria da “ligação dos receptores” a nível molecular.