A doença cardiovascular (DVC), baseada na aterosclerose e microangiopatia, é uma complicação importante da diabetes e é a principal causa de incapacidade e morte na diabetes. Os danos e disfunções das células endoteliais (CE) são os factores iniciadores no desenvolvimento e progressão das complicações vasculares diabéticas. Por conseguinte, tornou-se um tema quente de investigação para investigar os mecanismos dos danos endoteliais e encontrar formas eficazes de reparar a estrutura e função do endotélio danificado.
As células progenitoras endoteliais (EPCs) são células derivadas da medula óssea que podem expandir-se e diferenciar-se ainda mais em CE in vitro e participar na reparação e revascularização do endotélio danificado. A óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) é essencial para a capacidade migratória dos EPCs.
O stress oxidativo pode ser desencadeado por níveis elevados de glucose no corpo, o que, por sua vez, pode levar a uma diminuição da função dos EPC e a uma redução da produção de óxido nítrico (NO), enquanto que a intervenção com superóxido dismutase (SOD) pode levar a um aumento da secreção de NO e à restauração da função. As enzimas antioxidantes incluem superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutatião peroxidase (GSH-Px), enquanto os sistemas antioxidantes não enzimáticos incluem vitamina C, vitamina E, glutatião, melatonina, ácido alfa-lipóico (ALA), carotenóides, e oligoelementos tais como cobre, zinco e selénio (Se).
Neste estudo, os EPCs foram incubados com altas concentrações de glucose para induzir stress oxidativo, e os níveis de malondialdeído (MDA) e óxido nítrico (NO) em sobrenadantes de cultura foram medidos. A expressão do mRNA de GPx-1 e eNOS foi observada por RTPCR quantitativa de fluorescência em tempo real, e a expressão proteica de GPx-1 e eNOS foi determinada pelo western blot, seguido da aplicação do antioxidante ALA Em seguida, o antioxidante ALA foi utilizado para intervir para investigar o mecanismo dos danos induzidos pelo glucose-induzidos nas EPCs e medidas terapêuticas para fornecer uma base para a prevenção e tratamento de complicações vasculares diabéticas.
1. materiais e métodos
1.1 Materiais
1.1.1 Animais experimentais: 15 ratos Wistar machos saudáveis de grau limpo (peso 180-200 g), fornecidos pelo Centro de Animais Experimentais da Universidade Médica de Hebei, Certificado Animal Nº 902035.
1.1.2 Reagentes MDA e kit de ensaio NO (Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering), injecção de glucose a 50% (Huarui Pharmaceutical Co., Ltd.), meio EGM-2MV (LONZA, USA), isolado linfócito de rato (Tianjin Hao Yang Co., Ltd.);
Fibronectina humana (Solabank Technology Co., Ltd.), tripsina (sigma, EUA), reagente de extracção de RNA Reagente Trizol (Invitrogen, EUA), transcriptase reversa (M-MLV ), primários aleatórios todos produzidos pela Promega, anticorpo policlonal GPx-1 de coelho anti-humano (ABCAM, Reino Unido), policlonal de coelho anti-humano anticorpo eNOS (Santa, EUA), ALA (Eisai Pharmaceutical Co., Ltd., Japão).
1.1.3 Espectrofotómetro de instrumentos experimentais UV (756MC) (Shanghai Precision Instrument Science Co.
), ABI 7300 sistema de PCR quantitativa de fluorescência em tempo real (PE, EUA), sistema de varredura em gel UVP (UVP, EUA), instrumento de eletroforese de dupla constante DYZ22A e instrumento de eletroforese de ponte DYY-III (Beijing Liuyi Instrument Factory), microscópio invertido (Olympus, Japão), mesa ultra-limpa (HFsafe1200) (Likang Development Co., Ltd.), dióxido de carbono incubadora (MCO-15AC) (Heraeus, Alemanha), placas de cultura celular e garrafas de cultura (Corning, EUA)
1.2 Métodos experimentais
1.2.1 Cultura de medula óssea de rato EPCs
O membro inferior do rato foi removido com tesoura cirúrgica, a pele do membro inferior foi cortada, o membro inferior foi mergulhado em álcool a 75% durante 30 min, o fémur foi separado da tíbia ao longo da articulação do joelho numa mesa ultra-limpa, o músculo do membro inferior foi removido, o osso do membro inferior foi exposto em condições assépticas, mergulhado num prato de cultura contendo PBS, o osso do membro inferior foi cortado de ambas as extremidades, e a cavidade da medula óssea foi repetidamente lavada com PBS numa mesa ultra-limpa;
A solução de lavagem foi então lentamente sobreposta ao linfócito de rato isolado e centrifugado a 2000 rpm durante 20 min. Após centrifugação, o líquido no tubo foi dividido em três camadas, a camada branca nublada média foi aspirada, 4 vezes o volume de PBS foi adicionado e misturado, e o sobrenadante foi descartado e centrifugado durante 10 min. Após a centrifugação final, descarte o sobrenadante e adicione EGM-2MV para ressuspender as células.
O Fn foi espalhado em placas de poço a 5ug/cm2 e a suspensão celular foi inoculada em placas de seis poços e placas de 24 poços a uma densidade de 2×106 células/mL. O primeiro volume completo de fluido foi mudado após 48 horas, depois diariamente e de dois em dois dias após 7 dias. O crescimento celular foi observado diariamente sob um microscópio invertido.
1.2.2 Identificação de 2EPCs
Identificação morfológica: Observar diariamente a morfologia e o crescimento das células sob um microscópio invertido.
A absorção EPCs de DIL-Ac-LDL em combinação com a FITC-Lectin-UEA-1: foram adicionadas células no 10º dia de cultura ao meio contendo DIL-Ac-LDL (2,5ug/mL), incubado durante 4h, lavado 3 vezes com PBS, fixado em paraformaldeído a 2% durante 20min, depois foi adicionado FITC-Lectin-UEA-1 ( 10ug/mL), incubadas durante 1h, observadas ao microscópio confocal a laser, as células com coloração dupla como amarelo alaranjado eram EPC, e as células com coloração dupla foram contadas.
1.2.3 Agrupamento experimental
Os EPCs foram digeridos com 0,25% trypsin/0,02% EDTA durante 4 dias e agrupados durante 24 h.
Os EPCs foram incubados durante 48 h com glicose 5 mmol/L como controlo normal (NC), 30 mmol/l de glicose como glicose alta (HS) e glicose (30 mmol/l) + α ácido lipóico (40µg/l) como grupo ALA.
1.2.4 NO e MDA foram medidos pelo método químico colorimétrico, método Western blot para determinar a expressão de GPx-1 e eNOS em EPC, método RT-PCR quantitativo de fluorescência em tempo real para medir a expressão de GPx-1 mRNA em EPC.
1.3 Métodos estatísticos
Todos os dados foram analisados utilizando o pacote de análise estatística SPSS 13.0. Todos os dados de medição foram expressos como média ± desvio padrão ( ±s). Foram comparados meios de amostras múltiplas utilizando ANOVA unidireccional com um desenho completamente aleatório, e foram consideradas diferenças significativas em P<0,05.
2. resultados
2.1 Efeito de diferentes intervenções na secreção de MDA por EPCs (Quadro 3)
O nível de MDA sobrenadante da cultura foi superior ao do grupo de controlo normal após 48 h de intervenção com elevada glucose (P<0,05); o nível de MDA diminuiu após a aplicação da intervenção ALA em comparação com o grupo de elevada glucose (P<0,05).
2.2 Efeito de diferentes intervenções na expressão GPx-1 e eNOS em EPCs (Fig1-4, Quadro 1)
A expressão de GPx-1 e eNOS em EPCs foi significativamente inferior à do grupo de controlo 48 horas após a intervenção de alta glucose, enquanto a expressão de GPx-1 e eNOS em EPCs aumentou significativamente após a intervenção de ALA em comparação com o grupo de alta glucose (ambos P<0,05).
2.3 Efeito de diferentes intervenções na expressão GPx-1 e eNOS mRNA em EPCs (Fig5-8, Quadro 2)
Os níveis de expressão de GPx-1 e eNOS mRNA em EPCs foram significativamente inferiores aos do grupo de controlo após 48 horas de intervenção com elevada glucose, enquanto a expressão de GPx-1 e eNOS mRNA em EPCs aumentou significativamente após a intervenção com ALA em comparação com o grupo de elevada glucose (ambos P<0,05).
2.4 Efeito das diferentes intervenções sobre o nível de NO secretado nos CPE (Fig9, Quadro 3)
Após 48 horas de alta intervenção de açúcar, os EPCs secretaram níveis de NO inferiores aos do grupo de controlo normal (P < 0,05), enquanto que após a intervenção ALA, a expressão EPCs eNOS foi significativamente aumentada em comparação com o grupo de alto teor de açúcar (P < 0,05) e os níveis de NO sobrenadante da cultura foram aumentados.
3. discussão
Em 2004, na reunião anual da American Diabetes Association (ADA), Brownlee, um vencedor do Prémio Banting, deu uma palestra: tanto as complicações macrovasculares como microvasculares são causadas pela mesma patogénese, ou seja, o stress oxidativo, que é a base comum dos elevados danos causados pela glucose; no mesmo ano, a Associação Europeia para o Estudo da Diabetes (EADS) deu uma palestra sobre a importância da mesma patogénese, ou seja, o stress oxidativo. No mesmo ano, Ceriello, vencedor do prémio máximo na reunião anual da Associação Europeia para o Estudo da Diabetes (EASD), deu uma palestra sobre o stress oxidativo como mecanismo comum de resistência à insulina, diabetes e doenças cardiovasculares – a teoria comum do solo.
As EPCs são células precursoras presentes no sangue periférico em circulação que podem diferenciar-se em células endoteliais vasculares (CE) e são derivadas da medula óssea, sangue do cordão umbilical ou fígado fetal. Em casos de lesão vascular ou isquemia tecidual, as EPC presentes na medula óssea podem proliferar em resposta a factores de crescimento e citocinas localmente libertados, diferenciar-se em células endoteliais maduras, e mobilizar-se para a circulação periférica, onde se aninham especificamente no local da lesão ou isquemia para proliferar ainda mais e diferenciar-se em células endoteliais maduras, participando na neogénese vascular e na reendotelização.
Uma vez comprometidos o número e a função das EPC, o equilíbrio entre os danos e reparações endoteliais é perturbado e a integridade do endotélio é comprometida, resultando em lesões ateromatosas. As células progenitoras endoteliais desempenham portanto um papel importante na regulação do equilíbrio apoptose/regeneração e na manutenção da integridade da camada endotelial. A função das EPC está, portanto, intimamente relacionada com o desenvolvimento e progressão de complicações vasculares diabéticas e é um preditor de doenças cardiovasculares.
Dernbach et al[6] examinaram a sensibilidade oxidativa das EPCs adultas saudáveis e constataram que as EPCs adultas saudáveis tinham níveis intracelulares de ROS mais baixos e apoptose mediada por oxidantes inferiores às células endoteliais da veia umbilical, e que a expressão de antioxidantes como a superóxido dismutase de manganês (MnSOD), GSH-Px e CAT foi aumentada na superfície das EPCs em comparação com as células endoteliais da veia umbilical, sugerindo que as células humanas saudáveis Os EPC têm uma capacidade antioxidante mais forte do que as células endoteliais;
Isto promove a sua viabilidade, mas não é suficiente para contrariar os efeitos dos factores de risco no sistema endógeno antioxidante da EPC, que é desequilibrado no estado redox dentro das EPC sob elevados níveis de stress oxidativo, levando à apoptose e senescência, o que prejudica a sua função.
A glucose elevada do sangue pode activar o NADPH intracelular através da via PKC, gerando grandes quantidades de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e danificando as células, causando uma diminuição da bioactividade celular normal, perturbação do metabolismo energético, sinalização celular e outras funções, o que significa que o stress oxidativo pode ser induzido por níveis elevados de glucose. Foi também demonstrado que uma glucose elevada pode afectar a mobilização da medula óssea e a sobrevivência das EPCs através do stress oxidativo e do caminho P38MAPK.
Os doentes diabéticos e as EPCs tratadas com glucos causaram uma biodisponibilidade reduzida do NO ou uma diminuição da tetrahidrobiopterina (BH4), o co-factor da eNOS, que resultou no desacoplamento da eNOS, gerando iões superóxidos negativos (O-) e levando à acumulação de aglomerados de espécies reactivas de oxigénio (ROS), reduzindo ainda mais o número e a capacidade migratória das EPCs. O stress oxidativo em células mediadas por oxLDL desempenha um papel fundamental na patogénese da aterosclerose.
OxLDL afecta a função das EPCs ao promover a sua senescência através do seu efeito inibidor nas EPCs eNOS. Estudos recentes demonstraram que o ox-LDL em doentes diabéticos leva à disfunção das EPCs através de vias de sinalização mediadas por P53, em contraste com o HDL que é considerado como um factor protector da função vascular devido às suas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias.
Neste estudo, incubámos EPCs derivadas de medula de rato com elevada glucose durante 48h e mostrámos um aumento significativo dos níveis de MDA em sobrenadantes de cultura, sugerindo que a elevada glucose pode levar a stress oxidativo em EPCs. Isto pode levar à apoptose e danos no ADN oxidativo.
GPx-1 é uma proteína redox chave que desempenha um papel importante na protecção do endotélio contra o stress oxidativo e, portanto, na manutenção de um ambiente vascular estável. Estudos demonstraram que a actividade de GPx-1 é diminuída em placas de artérias carótidas isoladas. Foi também demonstrado que a sobreexpressão GPx-1 mantém a função endotelial vascular normal nas células endoteliais cultivadas com elevadas concentrações de cisteína.
Além disso, foi também demonstrado que a falta de GPx-1 não só resulta em disfunção endotelial vascular, mas também na presença de anomalias estruturais cardíacas e vasculares. Além disso, as células Ac-LDL+ Lectin+ VEGFR-2+ eNOS+ isoladas de ratos GPx-1 knockout são funcionalmente defeituosas na promoção da angiogénese e têm uma maior sensibilidade ao stress oxidativo, tanto in vivo como in vitro [21]. enzimas antioxidantes, enquanto levam à senescência e disfunção das EPCs in vivo, levando ainda mais ao aumento da apoptose.
eNOS é uma enzima do tipo citocromo P450 reductase-que catalisa a transferência mediada por flavina de electrões do doador de electrões NADPH para o cofactor de subtilisina. eNOS cofactor BH4 está localizado perto do grupo de subtilisina e pode transferir electrões para o azoto de L arginina para produzir NO. Na ausência de L arginina ou BH4, eNOS produz O2- e H2O2, um fenómeno conhecido como Este fenómeno é conhecido como desacoplamento eNOS.
eNOS desempenha um papel crítico na mobilização e regulação funcional das EPCs. O desacoplamento eNOS causa um aumento dos níveis de ROS e, portanto, prejudica a função das EPCs. Em pacientes diabéticos, o desacoplamento eNOS reduz o número de EPCs em pacientes diabéticos, diminuindo a sua função e, em última análise, levando ao desenvolvimento de doenças vasculares.
Foi demonstrado que o eNOS é uma substância importante para assegurar a capacidade migratória das EPCs. Os ratos knockout eNOS podem levar a uma diminuição da capacidade migratória das EPCs [25], e assegurar a expressão adequada do eNOS, a secreção normal de NO e a actividade biológica normal são factores importantes para manter a função biológica normal das EPCs. Neste estudo, aplicámos uma elevada concentração de glucose para intervir nas EPCs durante 48h e descobrimos que A expressão da proteína GPx-1 e os níveis de expressão de mRNA dos EPCs diminuíram, enquanto que houve uma diminuição da expressão de mRNA da proteína eNOS e da expressão de down-regulation e NO secretion;
Portanto, os resultados deste estudo sugerem que uma glicose elevada pode causar stress oxidativo em EPCs, para além de desregulamentar a expressão de enzimas antioxidantes, prejudicando assim a sua capacidade antioxidante e afectando a sua função.
O ALA é um antioxidante natural que pode limpar vários radicais livres produzidos durante processos fisiológicos e patológicos e reduzir o stress oxidativo no corpo. Estudos demonstraram que o ALA pode melhorar a função endotelial vascular em ratos, aumentando a actividade NO, reduzindo a produção de ROS [26] e inibindo a expressão de NF-κB, e pode também reduzir os níveis de stress oxidativo in vivo activando a via AMPK nas células endoteliais e invertendo a hiperpolarização da membrana mitocondrial induzida pelo glucose-induzido.
Neste estudo, ao aplicar ALA a EPCs incubadas com glicose elevada, descobrimos que a expressão de GPx-1 e eNOS não era preestabelecida em EPCs, e a secreção de NO por EPCs aumentava e a secreção de MDA diminuía, indicando que o tratamento ALA poderia reduzir o stress oxidativo produzido por EPCs induzidas por glicose elevada e restaurar a sua capacidade antioxidante, protegendo assim as suas funções.
Em conclusão, uma concentração elevada de glucose pode induzir stress oxidativo em EPC, por um lado, e reduzir a produção e expressão das suas enzimas antioxidantes e prejudicar a sua capacidade antioxidante, por outro lado, enquanto o tratamento de stress anti-oxidante pode melhorar a capacidade antioxidante e a capacidade de secreção de NO das EPC. Isto sugere que o tratamento de stress anti-oxidante tem implicações na prevenção e tratamento da ocorrência e desenvolvimento de complicações vasculares diabéticas.