O vírus da varíola dos macacos é encontrado na natureza principalmente em roedores africanos (esquilos africanos, esquilos das árvores, cangurus da Gâmbia, arganazes, etc.). Os primatas (macacos, chimpanzés, seres humanos, etc.) também podem ser infectados depois de entrarem em contacto com roedores infectados com o vírus da varíola dos macacos. Os animais infectados com o vírus da varíola dos macacos e os doentes com varíola dos macacos são a fonte de infeção desta doença. O vírus da varíola dos macacos invade o corpo principalmente através das membranas mucosas e da pele gretada. Os seres humanos são infectados principalmente através do contacto com secreções respiratórias, exsudados de lesões, sangue e outros fluidos corporais de animais infectados, ou por mordeduras ou arranhões de animais infectados. É principalmente transmitida entre pessoas através de contacto próximo, mas também pode ser transmitida através de gotículas durante um contacto próximo prolongado e pode também ser infetada pelo contacto com objectos contaminados com o vírus. Este surto de varíola dos macacos também revelou que a maioria dos casos tinha um comportamento sexual homossexual antes do aparecimento da doença, o que pode ainda estar principalmente relacionado com a transmissão através do contacto próximo durante as actividades sexuais, sendo incerto se a transmissão se fará através do sémen ou das secreções vaginais. O vírus da varíola dos macacos também pode ser transmitido de uma mulher grávida para o seu feto através da placenta.