215007 Instituto de Doenças Hepáticas, Suzhou Fifth People’s Hospital, Suzhou, China (Tong Fuyi Wu Jianhong Cao Wengui Wu Xingfu Fei Xiaofeng Ding Longqi)
[Resumo] Objectivo: Investigar a relação entre os marcadores do vírus da hepatite B (HBV-M) e a carga do HBV (HBV-DNA), e fornecer uma base científica para um diagnóstico clínico e tratamento adequados. MÉTODOS: O HBV-M e HBV-DNA foram detectados nos soros de 670 pacientes por imunoluminescência e fluorescência, respectivamente. resultados quantitativos da reacção em cadeia da polimerase: O HBeAg modo positivo HBV-DNA > 5,0e4 cps/ml representou 96,3% (363/377), o HBeAg modo negativo HBV-DNA > 5,0e4 cps/ml representou uma carga de HBV-DNA significativamente mais elevada no padrão HBeAg-positivo do que no padrão HBeAg-negativo (P < 0,05). A carga de HBV-DNA foi significativamente mais elevada no padrão 1,3,5 do que no padrão 1,4,5 (P < 0,01). 18,8% (12/64),e entre os padrões positivos anti-HBs, HBV-DNA >5,0e4 cps/ml representou 16,7% (7/42). Conclusão: A carga de HBV-DNA foi significativamente mais elevada no padrão HBeAg-positivo do que no padrão HBeAg-negativo. Contudo, alguns padrões HBeAg-positivos tinham níveis virais muito baixos e os padrões HBeAg-negativos tinham níveis virais elevados. Existem também infecções pelo HBsAg-negativo ou/e anti-HBs-positivo do HBV. Portanto, só a combinação de testes de carga de HBV-M e HBV pode determinar correctamente a doença e o prognóstico na prática clínica. Tong Fuyi, Departamento de Hepatologia, Suzhou Fifth People’s Hospital, Suzhou, China
[Palavras-chave] Vírus da hepatite B; reacção em cadeia da polimerase; quantificação da fluorescência; imunoenzima enzimática
Relação entre os modelos de marcadores serológicos e as quantidades de vírus em doentes infectados com o vírus da hepatite B
Tong Fuyi,Shaowei,Cao Wengui,et al. Departamento de Doenças Infecciosas, Suzhou Fifth People’s Hospital, Suzhou 215007
[Objectivo Compreender a relação entre os modelos de marcadores serológicos e as quantidades do vírus da hepatite B (HBV). Métodos Os marcadores serológicos do HBV em 670 pacientes foram detectados através da utilização do imunoensaio enzimático e as quantidades de HBV naqueles foram medidas através de Resultados Os pacientes HBeAg-positivos cujas cópias foram superiores a 5,0e4 /ml representaram 96,3%, e as cópias de HBV de pacientes HBeAg-positivos foram significativamente superiores aos pacientes HBeAg-negativos cujas cópias foram superiores a 5,0e4 /ml representaram 74,8%. As cópias do HBV de pacientes HBeAg-positivos eram significativamente mais do que pacientes HBeAg-negativos (P < 0,05). As cópias do HBV de doentes anti-HBe-positivos foram significativamente inferiores aos doentes anti-HBe-negativos (P < 0,01). O HBV-DNA foi detectado em alguns pacientes HBsAg-negativos (anti-HBs-positivos ou não). Conclusões As cópias do HBV de pacientes HBeAg-positivos eram significativamente mais do que HBeAg-negativos No entanto, algumas cópias do HBV de pacientes HBeAg-positivos são muito baixas, e algumas cópias do HBV de pacientes HBeAg-negativos são O HBV-DNA poderia mesmo ser detectado em alguns pacientes HBsAg-negativos (anti-HBs-positivos ou não). É útil avaliar o prognóstico exacto testando o marcador serológico e as quantidades de vírus.
É útil julgar o prognóstico exacto testando o marcador serológico e as quantidades de vírus. A PCR quantitativa (Q-PCR) tornou-se uma realidade devido ao salto em frente na tecnologia de reacção em cadeia da polimerase (PCR) nos últimos anos. Utilizámos o método da reacção quantitativa em cadeia da polimerase em fluorescência (FQ-PCR) para detectar HBV-DNA em 670 casos de pacientes infectados com HBV para explorar a relação entre a carga HBV-M e HBV.
1 Dados e métodos
1.1 Recolha de casos: 670 casos foram todos internados no nosso hospital de Janeiro a Outubro de 2002. Todos os casos não tinham utilizado medicamentos antivirais especiais, tais como interferon, lamivudina, α1 timidina, etc., nos últimos 3 meses. O sangue periférico foi recolhido, o soro foi isolado e testado no mesmo dia ou armazenado a -20°C.
1.2 Determinação do HBV-M: Instrumento de diagnóstico automatizado de imunoluminescência AXSYMTM da Abbott (EUA), com reagentes fornecidos pela Abbott como reagentes de apoio, operados por pessoal dedicado. Modo de relatório positivo: HBsAg (S/N) ≥ 2.00; anti- HBs (Miu/ml) ≥ 10.00; HBeAg (S/CO) ≥ 1.00; anti- HBeAg (S/CO) ≤ 1.00; anti-HBc (S/CO) ≤ 1.00.
1.3 Determinação quantitativa do HBV-DNA: Foi utilizado o método PCR quantitativo de fluorescência em tempo real. Foi utilizado o instrumento AcuGen System TMAG 9900 QRM Guantitation RoboMaster totalmente automatizado de PCR quantitativa, e os reagentes eram reagentes de apoio AcuGen System, fornecidos pela Shenzhen Baiyaktai (Biotronics) Company. A sensibilidade de detecção foi de 5,0e4cps/ml.
1.4 Tratamento estatístico: χ2 teste foi utilizado para a comparação de taxas.
2 Resultados
2.1 Dados do caso: um total de 670 pacientes, 515 homens e 155 mulheres. A relação macho:fêmea foi de 3,3:1, e a idade variou entre os 7 e 72 anos, dos quais 89,6% tinham entre 15-60 anos (600/670).
2,2 Padrões HBV-M: 14 padrões HBV-M foram encontrados. 8 padrões HBsAg-positivos totalizaram 591 casos, representando 88,2% do número total de casos (591/670), dos quais 1,3,5 padrões representaram 50,3% (297/591) e 1,4,5 padrões representaram 30,6% (181/591). O número total de padrões HBsAg-negativos foi de 9,6% (64/670) do número total de casos, incluindo 34,4% (22/64) para o padrão 2,4,5, 23,4% (15/64) para o padrão 4,5, e 21,9% (14/64) para o padrão 2,5. 15 casos foram completamente negativos para o HBV-M.
Tabela A relação entre o HBV-M e a carga HBV-DNA
Quadro 1 A relação entre o marcador do HBV e as quantidades de HBV
Marcador do vírus da hepatite B Número de casos HBV-DNA carregam as quantidades de HBV (cps/ml)
o marcador do HBV n ＜5.0e4(%) 5.0e4~4.9 e6(%) 5.0 e6~4.9 e8(%) ＞5.0 e8(%)
(-) (+) (++) (+++)
1,3,5 297 8(2.7) 69(23.2) 124(41.8)△ 96(32.3)▲
1,4,5 181 46(25.4) 67(37.0) 55(30.4)△ 13(7.2)▲
1,3,4,5 67 4(6.0) 20(29.9) 35(52.2) 8(11.9)
1,5 23 6(26.1) 10(43.5) 4(17.4) 3(13.0)
1,2,3,5 11 1(9.1) 3(27.3) 4(36.4) 3(27.3)
1,2,4,5 9 1(11.1) 4(44.4) 3(33.3) 1(11.1)
1,2,3,4,5 2 1(50.0) 1(50.0)
1 1 1(100.0)
2,4,5 22 18(81.8) 3(13.6) 1(4.5)
2,5 14 12(85.7) 2(14.3)
2 5 4(80.0) 1(20.0)
2,4 1 1(100.0)
4,5 15 12(80.0) 1(6.7) 2(13.3)
5 7 5(71.4) 2(28.6)
Negativo 15 14(93,3) 1(6,7)
Total 670 132 186 226 126
* 1: HBsAg, 2: anti-HBs, 3: HBeAg, 4: anti-HBe, 5: anti-HBc. △: P < 0.05; ▲: P < 0.01
2.3 Carga HBV: entre os padrões HBsAg-positivos: O padrão HBeAg-positivo HBV-DNA > 5,0e4cps/ml representou 96,3% (363/377),análise do padrão HBeAg-negativo HBV-DNA > 5,0e4cps/ml representou 74,8% (160/214). A carga de HBV-DNA foi significativamente mais elevada no padrão HBeAg-positivo do que no padrão HBeAg-negativo (χ2=6.07,P<0.05). Para padrões 1,3,5, HBV-DNA <5,0e4cps/ml representou apenas 2,7%, enquanto que HBV-DNA >5,0e4cps/ml representou 97,3% (289/297), dos quais HBV-DNA >5,0e6cps/ml representou 41. 8% (124/297) e HBV-DNA >5,0e8cps/ml foram responsáveis por 32,3% (96/297).1,4,5 Entre os padrões, HBV-DNA <5,0e4cps/ml foi responsável por 25,4%, enquanto que HBV-DNA >5. 0e4cps/ml representaram 74,6% (135/181), dos quais HBV-DNA >5,0 e6 cps/ml representaram 30,4% e HBV-DNA >5,0e8 cps/ml representaram apenas 7,2%. 1 A carga de HBV-DNA foi significativamente mais elevada nos padrões 1,3,5 do que nos padrões 1,4,5 (P < 0,01). e8 cps/ml; HBV-DNA <5,0e4 cps/ml representou 83,3% (35/42) do padrão positivo anti-HBs. Em 2 casos, 5 marcadores de HBV-M estavam presentes simultaneamente. (ver quadro)
3 Discussão
O HBV-M pode manifestar-se de muitas formas após a infecção pelo HBV. Os resultados deste estudo revelaram 14 padrões de anticorpos antigénicos. o padrão mais comum de positividade do HBsAg foi 1,3,5 padrão (43,0%). Entre os padrões HBsAg-negativos, 1,5 padrão (29,1%) e 2,4,5 padrão (27,8%) foram os mais comuns, seguidos por 4,5 padrão (19,0%) e 2,5 padrão (17,7%). E 2 casos foram considerados como positivos para o HBV-M.
O HBeAg é a expressão do mRNA da região pré-C/C do genoma HBV e está estreitamente relacionado com o HBV-DNA, pelo que normalmente os indivíduos HBeAg-positivos têm replicação viral activa e são altamente infecciosos, enquanto que os indivíduos HBeAg-negativos têm baixos níveis de replicação viral e são menos infecciosos. Os resultados do nosso estudo também confirmaram que o nível de HBV-DNA em pacientes HBeAg-positivos era significativamente superior ao dos pacientes HBeAg-negativos (P < 0,05). Isto é consistente com a maioria dos relatórios [1]. Contudo, no padrão HBeAg-positivo, havia ainda 3,7% de doentes com HBV-DNA <5,0e4 cps/ml, o que pode estar relacionado com a supressão da replicação do HBV por forte pressão imunitária do organismo ou devido à integração do HBV-DNA no sangue nos hepatócitos. No padrão negativo do HBeAg, há ainda 74,8% de doentes com HBV-DNA > 5,0e4 cps/ml e mesmo 7,2% de doentes com HBV-DNA > 5,0e8 cps/ml, que podem estar relacionados com mutações do gene do HBV, especialmente quando o gene pré-C ou o promotor do gene C é mutado, e o antigénio é difícil de ser expresso e a replicação viral ainda está presente [2,3].
O desaparecimento do HBsAg e a produção de anti-HBs implica sobretudo a recuperação da infecção pelo HBV ou o efeito protector da vacinação contra a hepatite B do organismo. Os resultados deste estudo mostraram que no HBsAg negativo, padrão positivo anti-HBs, ainda há 16,7% de pacientes com HBV-DNA > 5,0e4 cps/ml, apenas o nível viral não é, na maioria das vezes, elevado, o que pode estar relacionado com o baixo nível de replicação viral.A infecção pelo HBsAg negativo pelo HBV é um ponto quente de preocupação clínica durante vários anos. As razões para tal são: (i) a quantidade de antigénio é demasiado baixa para atingir níveis detectáveis; (ii) existe como um complexo antigénio-anticorpo, e quando os anticorpos são dominantes o antigénio é mascarado e o kit não é sensível e não pode ser detectado; (iii) variantes do gene HBV-S, nas quais algumas variantes na região hidrofílica principal não produzem HBsAg [4]. Pode dever-se a mutações no gene S que codifica o HBsAg: o “a” aglomerado determinante do gene S é o principal aglomerado determinante antigénico, e uma única substituição conservada de aminoácidos nesta região pode alterar a antigenicidade do HBsAg. Uma variação no aglomerado determinante “a” afecta a resposta global dos anticorpos. O HBsAg é detectado por reagentes de imunodiagnóstico convencionais, e os anti-HBs produzidos pelo organismo não podem neutralizar o HBV mutante, e existem diferentes subtipos de HBV com distribuição geográfica e polimorfismo na sequência do aglomerado determinante “a” [5]. No nosso estudo, descobrimos que pacientes com HBsAg negativo ou/e anti-HBs positivo tinham infecção pelo HBV num pequeno número de soros, e os títulos de HBsAg e HBeAg estavam correlacionados com os níveis de HBV-DNA [6]. níveis estavam correlacionados [6]. Além disso, os resultados dos testes anti-HBs podem estar relacionados não só com a fonte de reagentes mas também com diferenças na fonte da vacina contra a hepatite B recebida [7].
O processo de replicação viral é também acompanhado pela expressão de proteínas de embalagem, e estas proteínas heterólogas (antigénios) estimulam o sistema imunitário do organismo a produzir os anticorpos correspondentes. Assim, os anticorpos antigénicos reflectem o nível de expressão viral e, indirectamente, o nível de replicação viral. Os métodos serológicos também podem ser utilizados para a análise da etiologia da hepatite B (diagnóstico etiológico), infecciosidade, progressão da doença e prognóstico. No entanto, a expressão do HBV e a força da resposta imunológica do organismo são influenciadas por vários factores, e é possível que os indicadores imunológicos não correspondam exactamente aos fenómenos clínicos e à carga viral [8]. Devido à utilização generalizada de inibidores da transcriptase inversa do HBV e à presença generalizada de variantes virais, muitos fenómenos clínicos já não podem ser totalmente explicados apenas pelos indicadores imunológicos. Os testes serológicos não são um substituto completo dos testes de HBV-DNA. A carga viral é um indicador mais quantitativo do que a serologia, e pode ser mais precisa e sensível do que os indicadores serológicos para reflectir os fenómenos clínicos e as suas tendências de mudança. No entanto, os dois não podem substituir-se completamente um ao outro. Portanto, os testes clínicos de HBV-M devem ser acompanhados por testes dos níveis de HBV-DNA, e a combinação dos dois pode determinar correctamente a doença e o prognóstico, se a ênfase unilateral de um dos lados for tendenciosa.
Referências
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infecção com um ensaio de PCR quantitativo. Clin Diagnostic Lab Immunol 2000;7:298~300
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3 Fujiwara K, Yokosuka O, Ehata T, et al. Os dois estados diferentes do ADN do vírus da hepatite B em
portadores assintomáticos: Portadores assintomáticos Hbe-antigénio-positivos versus anti-HBe -positivos assintomáticos. Dig Dis Sci 1998;43:368~376
4 Luo, Anti-Sen, ed. Hepatite B básica e clínica. 2ª ed. Pequim: People’s Health Publishing House, 2001, 334~335
5 Tong F.Y., Bai J.Y., Tang Y.H., et al. Estudo do polimorfismo da sequência genética do vírus da hepatite B S no sul de Jiangsu. Chinês e ocidental
Journal of Combined Medical and Liver Diseases, 2002;12(5):260~262
6 Shao W, Tong FY, Ruan CJ. Relação entre os títulos HBsAg e HBeAg e os níveis HBV-DNA. Gastroenterologia e Hepatologia
Zhi, 2003;12(5):475~476
7 Heijtink RA, Schneeberger PM, Postma B, et al. Os níveis de anti-HBs após a imunização contra a hepatite B dependem dos reagentes de teste: níveis de seroprotecção 10 e 100IU/L determinados rotineiramente não fiáveis. Vacina,2002,20:2899~2905
8 Weston SR, Martin P. Testes serológicos e moleculares em hepatite viral: uma actualização. can J
Gastroenterol,2001,15:177~184