O metotrexato tem uma actividade anti-tumoral de largo espectro e pode ser utilizado sozinho ou em combinação com outros agentes quimioterápicos. Tem geralmente uma vasta gama de indicações. Em primeiro lugar, pode ser usado sozinho na terapia anti-tumoral, como o cancro da mama, chorocarcinoma, hiperemese maligna ou quilotórax. Em segundo lugar, também pode ser usado em combinação com terapia anti-tumoral, como leucemia aguda, linfoma de Burkitt, linfossarcoma avançado, etc. Em terceiro lugar, pode ser usado em doses elevadas ou em combinação com outros agentes quimioterápicos para tratar osteosarcoma, leucemia aguda, carcinoma broncopulmonar, ou carcinoma epitelial da cabeça e pescoço, etc. Quando se utilizam doses elevadas de metotrexato, é necessário aplicar tetrahidrofolato de formilo para alívio.