A disfunção endotelial é a fase patofisiológica precoce da aterosclerose e desempenha um papel fundamental no desenvolvimento de complicações macrovasculares, sendo o stress oxidativo um dos mecanismos da aterogénese.
As células progenitoras endoteliais (EPCs) são um grupo de células estaminais/progenitoras que residem na medula óssea e podem especificamente aninhar-se no endotélio danificado e diferenciar-se e proliferar em células endoteliais maduras. Proliferam e diferenciam-se ainda mais em células endoteliais maduras, que participam na neogénese vascular e na reendotelização.
Fadini GP et al. estudaram EPCs em pessoas com regulação da glicose e T2DM deficiente e mostraram que em pessoas com regulação da glicose deficiente, ou seja, na fase pré-diabética, já havia uma diminuição do número de EPCs, sugerindo que a diminuição das EPCs acompanha o curso natural da diabetes mellitus, e sugeriu que o aumento dos factores de risco cardiovascular na fase pré-diabética não está apenas relacionado com os danos endoteliais causados pela hiperglicemia e outras anomalias metabólicas concomitantes Ele concluiu que o aumento dos factores de risco cardiovascular na pré-diabetes não está apenas relacionado com os danos endoteliais devidos à hiperglicemia e outras anomalias metabólicas concomitantes, mas também com a deterioração da regeneração endotelial devido ao esgotamento das células progenitoras circulantes, e que o declínio das células progenitoras circulantes leva a uma acumulação de factores de risco cardiovascular. O stress oxidativo é um factor influente no declínio das EPCs.
A diabetes tipo 2 é agregada familiarmente e as suas crianças estão em alto risco de desenvolver diabetes, e o nosso estudo anterior mostrou que a disfunção endotelial vascular já está presente nas crianças de diabéticos do tipo 2 com tolerância normal à glicose. Existe alguma alteração no número de EPC nesta população, existe stress oxidativo, e qual é a relação entre eles? Há uma escassez de investigação nesta área.
Neste estudo, examinámos alterações na função vasodilatadora dependente do endotélio (FMD), EPCs circulantes, oxidantes séricos e antioxidantes em doentes com diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) e seus parentes de primeiro grau (FDRs), e investigámos a relação entre eles a fim de fornecer uma base para a prevenção e tratamento do desenvolvimento do T2DM e suas complicações macrovasculares.
Materiais e Métodos
I. Temas de estudo
Um total de 40 pacientes com diabetes mellitus tipo 2, 22 homens e 18 mulheres, com idades compreendidas entre os 44,78±1,82 anos, diagnosticados por testes de tolerância à glucose (OGTT) ambulatoriais e hospitalares de 2008-2009, foram seleccionados como o grupo diabético.
Foram seleccionadas 38 indivíduos, 20 homens e 18 mulheres, com idades compreendidas entre os 46,87±1,91 anos, foram excluídos da glicemia em jejum, tolerância à glicose e diabetes mellitus; grupo de controlo normal (NC) 30 indivíduos, 17 homens e 13 mulheres, com idades compreendidas entre os 44,07±1,89 anos, sem historial familiar de diabetes mellitus. Todos os sujeitos foram examinados por electrocardiograma, ultra-som, sangue, urina e fezes na gama normal. Todos os sujeitos foram excluídos da hipertensão, doença coronária, doença cerebrovascular e doença vascular periférica, sem disfunção hepática ou renal, excluídos de tomar medicamentos que afectam o metabolismo do corpo, e excluídos do tratamento com insulina.
II. Métodos
Determinação dos índices bioquímicos do sangue: a glucose foi determinada pelo método da glucose oxidase, o HBAlc foi determinado pelo método químico; o lipídio no sangue (colesterol, triglicérido) foi determinado pelo método enzimático, utilizando o instrumento bioquímico automático Beckman L20 americano; superóxido dismutase (SOD), malondialdeído (MDA), glutatião peroxidase (GSH-PX), capacidade antioxidante total ( TAO-C) foram determinados pelo método colorimétrico e os kits foram adquiridos ao Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering. A determinação da insulina foi realizada pelo método da quimioluminescência.
2. a sensibilidade à insulina e os índices relacionados com a função das células B de ilhotas foram calculados utilizando as seguintes fórmulas.
Índice de resistência à insulina modelo de estado estável (HOMA-IR) = (FPG×FIns)/22,5.
3. contagem de EPC de sangue periférico: tomar 2mL de sangue periférico, adicionar 150ul de sangue total a cada tubo de ensaio de fluxo, adicionar 10ul de anticorpos primários; adicionar 10ul de tampão ao tubo de controlo de isótipos. Misture suavemente. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente, depois adicionar 2 ml de lisado de eritrócitos a cada tubo, misturar bem e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente, evitando a luz. As células foram lavadas uma vez com 2ml de tampão, ressuspendidas em 500ul de tampão e detectadas num fluxómetro.
As células CD34+KDR+ foram identificadas como EPC (os kits foram adquiridos à Invitrogen e I&D). O analisador FACS Calibur (BD, EUA) foi utilizado para analisar e contar 1 × 105 células; os dados foram depois processados com software (Macintosh CELLQuest; BD Biosciences).
4. medição da função endotelial vascular dependente do endotélio (FMD): medida pelo método de varredura bidimensional por ultra-som (PHILIPS HDI 5000, General Motors, EUA): o paciente estava deitado numa posição plana, o manguito do esfigmomanómetro estava amarrado ao antebraço direito, o manguito estava inflado até 50 mmHg acima da pressão sistólica e deflacionado após 5 min para causar congestão reactiva, as imagens da artéria braquial foram adquiridas dentro de 30-90 s e combinadas com O diâmetro interno diastólico final (Dd1) foi medido dentro de 30-90s e combinado com um ECG. A alteração do diâmetro interno da artéria braquial após congestão reactiva (FMD%) = (Dd1-Dd)/Ddd×100%.
III. processamento estatístico
O pacote de análise estatística SPSS 13.0 foi utilizado para análise. Todos os dados de medição foram expressos como média ± desvio padrão, e os resultados medidos foram testados quanto à normalidade e qui-quadrado. Foi utilizada ANOVA unidireccional para comparação entre múltiplos grupos para os dados de medição, e o teste SNK-q foi utilizado para comparação bidireccional entre grupos, sendo P<0,05 considerado como uma diferença significativa. A análise de correlação linear e a análise de regressão linear múltipla foram utilizadas para correlacionar as variáveis.
RESULTADOS
1. características clínicas e bioquímicas dos três grupos
Como se pode ver no Quadro 1, os três grupos foram combinados para idade e sexo. não houve diferença significativa no IMC entre os três grupos. FPG e HbA1c foram significativamente mais elevados no grupo T2DM em comparação com os grupos de controlo e FDRs (P<0,05), mas não houve diferença significativa entre os grupos de controlo e FDRs (P>0,05). Os níveis de TC foram mais elevados no T2DM do que nos grupos FDRs e NC (P<0,05), mas o TG não foi significativamente diferente nos três grupos; HOMA-IR aumentou gradualmente nos grupos de controlo, FDRs e T2DM, com diferenças significativas (P<0,05).
2. comparação de indicadores de stress oxidativo e adipocinas nos três grupos
Como se pode observar na Tabela 2, os níveis de SOD, TAO-C e GSH-PX no grupo T2DM foram significativamente mais baixos no grupo T2DM do que no grupo de controlo e FDRs (P<0,01), mas não houve diferença estatística entre os FDRs e os grupos de controlo (P>0,05); os níveis de MDA do soro aumentaram gradualmente no grupo de controlo, FDRs e grupo T2DM (P<0,01).
3. comparação de vários parâmetros relacionados com a função endotelial nos três grupos
Como se vê no Quadro 3, os EPCs e a febre aftosa diminuíram gradualmente nos grupos de controlo, FDRs e T2DM, e as diferenças foram estatisticamente significativas (P<0,05).
Discussão
Em 1997, Asahara et al. descobriram que existe uma célula precursora no sangue periférico em circulação capaz de se diferenciar em células endoteliais vasculares (ECs), chamadas EPCs, que são derivadas da medula óssea, sangue do cordão umbilical ou fígado fetal e exprimem certos marcadores específicos, tais como marcadores de células progenitoras hematopoiéticas: CD34 , CD133 e receptor-2 do factor de crescimento endotelial vascular (VEGFR-2) [também conhecido como kinase receptor de região funcional (KDR) ou kinase-1 do fígado fetal (FLK-1)] e marcadores endoteliais como o CD31.
Os EPC podem ser isolados e cultivados in vitro e a sua identidade e função determinadas. No entanto, não podem ser utilizados em estudos clínicos em larga escala devido ao seu elevado custo. Portanto, a análise dos antigénios de superfície por citometria de fluxo para identificar células progenitoras é considerada como o padrão de ouro. Muitos estudos sugerem agora que as células CD34+KDR+ podem ser utilizadas como EPCs. O CD34 é um marcador importante de células estaminais hematopoiéticas, enquanto o KDR, o primeiro marcador celular do sistema vascular, é um receptor chave para a angiogénese do sangue embrionário e também tem sido utilizado como um importante marcador molecular para EPCs vasculares.
Em condições normais, o número de EPCs é relativamente baixo, mas em casos de lesão vascular ou isquemia tecidual, as EPCs presentes na medula óssea podem responder aos factores de crescimento libertados localmente e às citocinas e mobilizar-se para a circulação periférica, onde são especificamente alojadas no local da lesão ou isquemia. Proliferam e diferenciam-se ainda mais em células endoteliais maduras, que participam na renovação vascular e reendotelização.
Quando as células progenitoras endoteliais são danificadas, o equilíbrio entre o dano endotelial e a reparação é perturbado e a integridade da camada endotelial é perturbada, resultando em lesões ateromatosas. Os EPCs também secretam factores de crescimento para activar células endoteliais maduras na vasculatura e manter a função normal do endotélio.
Por outras palavras, o número e a função das EPCs na medula óssea e no sangue periférico determinam a extensão da reparação endotelial nos vasos danificados, pelo que as EPCs são consideradas como um importante factor bioquímico no tratamento de várias doenças cardiovasculares e vasos danificados.
A diabetes mellitus é um risco equívoco de doença cardiovascular, e a diabetes mellitus tipo 2 está associada a uma elevada incidência de doença cardiovascular e mortalidade. Este estudo mostrou que o número de EPCs foi significativamente reduzido nos FDRs e T2DM em comparação com os controlos, e que a febre aftosa foi significativamente reduzida, sugerindo que um número reduzido de EPCs e uma função endotelial vascular comprometida já estavam presentes em parentes de primeiro grau de pacientes diabéticos com tolerância normal à glicose.
O stress oxidativo (OS) refere-se a um processo patológico em que a produção excessiva de grupos reactivos de oxigénio (ROS), bem como de grupos reactivos de azoto (RNS) no organismo e/ou a reduzida capacidade antioxidante do organismo leva a uma menor depuração das moléculas reactivas em condições de stress como isquemia, hipoxia e hiperglicemia, resultando num desequilíbrio entre os sistemas oxidativo e antioxidante, levando ao aumento dos níveis de radicais de oxigénio nos tecidos e causando danos nos tecidos ou potenciais danos Enzimas antioxidantes
As enzimas antioxidantes incluem superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), GSH-PX, etc. O TAO-C representa o nível global de antioxidantes enzimáticos celulares e não enzimáticos. O stress oxidativo é um dos mecanismos que causam complicações vasculares diabéticas, e a diminuição da actividade GPx-1 e MnSOD são agora considerados como factores de risco independentes para eventos cardiovasculares em doentes com doença arterial coronária.
Os resultados deste estudo mostraram que os níveis de SOD , TAO-C e GSH-PX no soro eram significativamente mais baixos no grupo T2DM do que nos grupos NC e FDRs, e os níveis de MDA no soro eram significativamente mais elevados nos FDRs e T2DM, sugerindo que já existe um desequilíbrio nos sistemas oxidativos e antioxidantes em parentes de primeiro grau do T2DM com tolerância normal à glucose, o que é consistente com relatórios anteriores [8].
A análise de correlação de Pearson mostrou que nos FDRs, a IR estava positivamente correlacionada com MDA e negativamente com SOD, TAO-C e GSH, sugerindo que o stress oxidativo está intimamente associado à IR em parentes de primeiro grau com diabetes. Foi demonstrado que a resistência à insulina e o aumento dos lípidos intracelulares nos miócitos em parentes normoglicémicos nãoobesos de primeiro grau de pacientes T2DM apresentam stress oxidativo devido a disfunção mitocondrial no músculo esquelético [9], e a IR é um mecanismo de defesa fisiológica contra o excesso de ROS a nível celular do corpo.
Em comparação com outras células tecidulares, as células β têm baixos níveis de enzimas de absorção de radicais livres (enzimas antioxidantes), bem como de proteínas de absorção de ROS como a tioredoxina, sendo por isso extremamente sensíveis a ROS vivas e mais vulneráveis ao ataque de stress oxidativo; assim, quando o sistema endógeno antioxidante é inadequadamente compensado, o corpo experimenta um desequilíbrio redox, activando vias de sinalização sensíveis ao stress, causando disfunções das células β e agravando ainda mais IR, conduzindo em última análise ao desenvolvimento do T2DM e às suas complicações crónicas.
A partir disto podemos especular que o stress oxidativo ocorre devido a factores genéticos e ambientais, os quais se promovem mutuamente e levam ainda mais à resistência à insulina e à falência de células β, induzindo assim o aparecimento e desenvolvimento da diabetes e das suas complicações.
A análise de regressão linear múltipla utilizando EPCs como variável dependente mostrou que TOA, MDA, GSH-PX, FBG e HbA1c entraram na equação (R=0,979, P<0,05), com diferenças estatisticamente significativas, indicando que os níveis de glucose no sangue e o stress oxidativo são factores influentes nos EPCs.
A hiperglicemia e os seus metabolitos podem afectar as EPCs e a função endotelial vascular de várias maneiras, levando a complicações vasculares através delas.
(1) Glicose elevada e TNF-α baixam o número de EPCs activando p38-MAPK em EPCs;
(2) A glucose elevada medeia o desequilíbrio da fosforilação/acetilação do factor de transcrição FoxO, o que pode aumentar a expressão da proteína FoxO, upregular a expressão do gene pró-apoptótico e mediar a apoptose das EPCs. FoxO, levando ainda mais a uma função EPC deficiente.
(3) A glucose elevada conduz a uma diminuição da biodisponibilidade do NO libertado pelos EPC ou a uma diminuição do co-factor do eNOS, tetrahidrobiopterina (BH4), o que resulta no desacoplamento do eNOS e na geração de iões superóxidos negativos (O-), levando à acumulação de grupos de espécies reactivas de oxigénio (ROS), reduzindo ainda mais o número e a capacidade de migração dos EPCs.
(4) A hiperglicemia afecta a função endotelial vascular ao prejudicar a função das EPCs e ao libertar matéria particulada (MPs), o que pode promover a formação de trombos e fibrinas ao iniciar vias de coagulação exógenas e ao formar polímeros com plaquetas; activando neutrófilos, promovendo a ligação de células monócitos-endoteliais e a quimiotaxia aos neutrófilos, e participando na resposta inflamatória.
O stress oxidativo afecta a função e o número de EPCs, promovendo a regulação da sua morte. As estatinas inibidoras de HMG2CoA redutase protegem os EPCs da apoptose induzida pelo stress oxidativo, inactivando os factores de transcrição da cabeça do garfo através da via de sinalização PI3/Akt, diminuindo assim os níveis de expressão de Bim;
O stress oxidativo também pode causar apoptose em EPCs através da via ROS-p53-Bax [14], que induz a inactivação da telomerase em EPCs e promove a sua senescência e regulação. Foi relatado que o estudo de Eric também mostrou que a aplicação de superóxido de manganês dismutase (MnSOD) transfectado EPCs promovia a cura de membros feridos em ratos diabéticos.
Em conclusão, o presente estudo sugere que a resistência à insulina, o stress oxidativo, a redução do número de células progenitoras endoteliais e o comprometimento da função endotelial vascular já estão presentes em parentes de primeiro grau da diabetes tipo 2 com tolerância normal à glucose, e que o stress oxidativo pode ser o factor iniciador da diabetes e das suas complicações vasculares.