A glicemia em jejum é o sangue colhido após um jejum noturno e antes do pequeno-almoço. Normalmente, para medir a glicemia em jejum, é necessário estar em jejum durante mais de 8 horas, e não se deve voltar a consumir snacks e fruta. Se o sangue for colhido às 8:00 horas da manhã seguinte, não deve ser consumido qualquer alimento depois das 12:00 horas da noite anterior. Se os doentes estiverem preocupados com o efeito nos resultados, podem prolongar um pouco mais o tempo de jejum, por exemplo, 10 horas de jejum. De facto, não há grandes restrições quanto à ingestão de água, podendo beber-se pequenas quantidades de água fresca e morna, desde que não se adicione açúcar à água. A alimentação do dia anterior deve manter-se normal, com uma certa quantidade de hidratos de carbono, cerca de 100g. Se for deliberadamente reduzida, terá um efeito na medição dos valores de glucose no sangue. Além disso, a alimentação do dia anterior deve ser ligeira, mais ou menos igual à habitual, sem grandes quantidades de peixe, carne e álcool, para não influenciar a glicemia do dia seguinte. Os doentes devem também abster-se de exercício físico extenuante e de flutuações emocionais no dia anterior à colheita da glicemia em jejum, porque as flutuações emocionais e o exercício físico extenuante podem provocar uma secreção excessiva de glucagon. Como muitos doentes com problemas de glicemia têm também problemas de insulina, a insulina pode ser analisada juntamente com a glicemia.