I. Visão geral da metástase hepática do cancro colorrectal
O fígado é o órgão mais comum e metastático para tumores colorrectais. Há informações de que cerca de 150.000 novos cancros colorrectais são descobertos todos os anos nos Estados Unidos, e 1/4-1/3 deles pertencem à fase avançada, ou seja, à fase IV da fase TNM. Em 1990, segundo a American Cancer Society, 61.000 pessoas morreram de cancro colorrectal nesse ano, das quais quase 40.000 morreram de metástases hepáticas.
Na altura da consulta inicial, cerca de 10% eram da fase A da Duke, 20%-30% da fase B, 30%-40% da fase C, e os restantes eram doentes metastáticos. O órgão mais predominante das metástases é o fígado. Cerca de 60% dos pacientes têm metástases no momento do primeiro diagnóstico de cancro colorrectal. Dentro de 5 anos após a ressecção cirúrgica da lesão primária, as metástases hepáticas podem ocorrer em 50% dos doentes. Tem sido relatado que as metástases hepáticas podem ocorrer em 36%-81% dos casos de cancro colorrectal na autópsia após a morte [3]. Esta elevada incidência pode ser um factor importante que afecta o nível global de tratamento de tumores colorrectais.
Quanto à sobrevivência natural das metástases hepáticas do cancro colorrectal sem qualquer tratamento, é geralmente curta, com uma sobrevivência média de 6-10 meses e uma sobrevivência média de 4,5 ou 6,6 meses, e mesmo uma taxa de sobrevivência de seis meses de 0 foi relatada em alguns casos [1]. A situação acima descrita ilustra plenamente que a metástase hepática do cancro colorrectal tem um mau prognóstico se não for tratada activamente, e é uma das principais causas de morte por cancro colorrectal.
Infelizmente, apenas cerca de 20% dos doentes com metástases hepáticas são adequados para tratamento cirúrgico no momento do diagnóstico devido ao tamanho excessivo das metástases hepáticas, à sua estreita relação com grandes vasos sanguíneos e às múltiplas metástases no fígado [4]. De acordo com o estado actual, parece difícil melhorar a taxa de ressecção cirúrgica simplesmente através da melhoria das técnicas cirúrgicas. Apenas através da detecção precoce da existência de metástases hepáticas é possível tratá-las o mais cedo possível, aumentando assim a taxa de sobrevivência e melhorando o prognóstico.
Mecanismos de formação de metástases hepáticas de cancro colorrectal
A formação de metástases hepáticas a partir do cancro colorrectal é um processo complexo que envolve o papel de múltiplos factores entre as células tumorais e o hospedeiro. Os principais processos da sua metástase incluem.
1. Invasão da matriz extracelular No local dos focos primários, a adesão entre as células cancerosas é reduzida, a densidade de carga na superfície das células cancerosas é aumentada, a força repulsiva mútua é aumentada, as células são fáceis de mover, e várias enzimas segregadas pelas células tumorais (tais como proteases de serina e metaloproteinases de matriz) digerem a matriz extracelular e são fáceis de aderir e ligar com a membrana do porão, resultando em células tumorais rompendo a barreira formada pelo tecido conjuntivo.
2. Entrada no sistema portal As células cancerosas aderem à membrana do porão e às células endoteliais vasculares, o citoesqueleto endotelial vascular é afectado e a lacuna celular é aumentada. Sob a acção da metaloproteinase matriz, heparinase, citoquinase, elastase e uroquinase, as células cancerosas atravessam o endotélio vascular e a membrana do porão e entram no sistema portal.
3.Cancer células sobrevivem na circulação A maioria das células cancerígenas que entram no sangue são mortas pelo hospedeiro, algumas estão inactivas, e uma pequena subpopulação de células com elevado potencial metastásico pode aderir ao endotélio vascular e penetrar na parede do vaso para formar focos metastásicos.
4.Proliferation de células cancerosas no fígado Se as células cancerosas podem crescer num novo microambiente depois de penetrarem nos vasos sanguíneos é a chave para a formação final de focos metastáticos. As células cancerígenas só podem formar metástases hepáticas quando proliferam microvascularmente sob condições microambientais intra-hepáticas adequadas [7].
A formação de metástases hepáticas a partir do cancro colorrectal está relacionada com as características biológicas das células cancerosas, o estado imunitário do corpo e o microambiente do fígado. A formação de metástases hepáticas CRC pode ser simplesmente expressa da seguinte forma: cancro colorrectal primário – sangue do tracto venoso portal – fígado – veia hepática para a circulação pulmonar para todo o corpo (ou para a bílis).
III. Marcadores moleculares relacionados com metástases hepáticas do cancro colorrectal
Infiltração e metástase beneficiam do envolvimento de algumas proteínas, tais como estimulação da adesão entre células tumorais e células hospedeiras ou matriz extracelular; hidrólise proteica de células tumorais para hospedar barreiras tais como membrana basal, movimento direccional de células tumorais, e crescimento clonal dentro do órgão alvo.
(I) Alteração dos receptores relacionados com a aderência das células
1. sistema proteína calmodulina-igante: β-cadherin (β-catenin) é uma proteína citoesquelética que se liga ao término-C de calmodulin (E-cadherin) e o término-N se liga ao α-cadherin (α-cat), formando o complexo E-cad/β-cat/α-cat, que é anexado aos filamentos de actina pelo α-cat [8] . o E-calmodulin O complexo E-cad/β-cat/α-cat é a principal molécula de adesão que mantém a polaridade, morfologia e integridade histológica das células epiteliais. Com a perda da função complexa, a adesão intertumoral das células diminui e separa-se facilmente, invadindo o tecido circundante. Foi demonstrado que a eliminação de β-catenin está associada à metástase hepática no cancro colorrectal [9].
Antigénio carcinoembrionário (CEA): O CEA é uma glicoproteína de superfície celular altamente glicosilada, membro da superfamília da imunoglobulina, que é uma molécula de adesão de células tumorais e desempenha um papel importante na recorrência e metástase do cancro colorrectal. É mais amplamente utilizada na detecção precoce da metástase hepática do cancro colo-rectal [10]. Os receptores CEA estão presentes nas células Kupffer hepáticas e induzem citoquinas (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNFα) secreção das células Kupffer. Ela induz a expressão de moléculas de adesão intercelular por células endoteliais sinusoidais hepáticas, aumentando assim a adesão e retenção tumoral no fígado [11].
3. CD44: O factor de adesão CD44 na superfície das células tumorais é um receptor hialuronano transmembrana que medeia a adesão às células endoteliais. Pensa-se que a alta expressão das suas variantes CD44v6 e CD44v8-10 está intimamente relacionada com a metástase hepática do cancro colorrectal [12,13].As variantes de emendas CD44 podem afectar a migração e motilidade das células tumorais, promovendo a adesão das células tumorais às células endoteliais vasculares e à matriz extracelular, promovendo a invasão das células tumorais no estroma, e afectando a agregação e distribuição das proteínas tumorais citoesqueléticas A combinação de vários aspectos afecta assim a formação de metástases tumorais [14]. As células tumorais que expressam as variantes CD44 podem escapar ao reconhecimento pelo sistema imunitário hospedeiro durante o processo de metástase e ser poupadas à eliminação.
Integrinas: Estas moléculas intermediam principalmente a adesão das células à matriz extracelular (ECM), permitindo a integração do esqueleto intracelular com a matriz extracelular para formar um todo, e estão também envolvidas na adesão de célula a célula. Mede a adesão principalmente através do reconhecimento de sítios tripeptídicos de argininina-glicina-aspartate (RGD).Takamura H et al. mostraram coloração positiva para integrina αVLA3 em 58% (11/19) dos tecidos de cancro colorrectal com metástases hepáticas utilizando ensaios imuno-histoquímicos, que foi significativamente mais elevado em comparação com os tecidos não-metastáticos (0%). O aumento da integrina α3β1 sugere que esta pode desempenhar um papel importante na metástase hepática do cancro colo-rectal.
5, Sialylated Lewis oligosaccharide-X (sLex) antigene: SLX é também um ligando para a molécula de adesão leucocitária endotelial-1 (ELAM-1), como receptor de E-selectina na superfície das células endoteliais vasculares hepáticas. ligando de ELAM-1, que desempenha um papel importante na metástase hepática do cancro colorrectal. Células tumorais com alta expressão de antígeno sLex expelido dos focos primários, entram na vasculatura, aderem ao endotélio vascular hepático e crescem e formam metástases hepáticas, que são mais susceptíveis de se infiltrarem na membrana basal, aderem às células vasculares endoteliais humanas activadas e formam metástases hepáticas. Estudos confirmaram que a expressão do antigénio sLex em focos metastáticos de cancro colorrectal é mais forte do que a do antigénio sLex nos focos primários [18,19].
Os antigénios associados ao tumor CA 19-9 e sLex são expressos em todo o cólon. Estes glicogénios são elevados à medida que o cancro do cólon evolui de tumores não-metastáticos para tumores metastáticos, e o sLex é uma característica comum das células cancerosas do cólon que tendem a metástase. Certos antigénios associados aos antigénios do soro estão também associados à progressão do tumor; os níveis de antigénios CA19-9 são significativamente mais elevados no adenoma e no cancro do cólon do que na mucosa normal. Outras lectinas tais como a lectina ligante à lactose ou a lectina-3 (galectina-3) também têm sido associadas à transformação tumorigénica e à evolução metastática [20, 21].
(ii) Alterações da protease
As células tumorais destacam-se da membrana basal ou da matriz extracelular, e as proteases celulares degradam a membrana basal ou a matriz extracelular para se infiltrarem nos vasos linfáticos ou nos vasos sanguíneos para constituírem infiltração e metástase. As proteases degradantes de matriz extracelular (ECM) incluem proteases serinas, metaloproteases, elastases e proteases cisteínicas. Entre elas, a família das metaloproteinase (MMPs) é considerada como o grupo mais importante de proteases e um alvo importante para as metástases anti-tumorais. As mais estudadas no cancro colorrectal são as metaloproteinases de matriz e a uroquinase, etc.
1. Matrix metalloproteinases (MMP) A MMP é uma endopeptidase dependente do metal com actividade protease contra vários componentes da ECM. É regulada por inibidores de tecidos de metaloproteinases (TIMP) e metaloproteinase de matriz tipo membrana (MT-MMP).
A MMP pode ser dividida nos seguintes grupos: colagenases (ou gelatinases), estromelysina, matrilysina, e MT-MMT. as colagenases mais importantes são a MMP-2 e -9, que hidrolisam o colagénio da ECM. A MMP no tecido normal do cólon está presente apenas nos neutrófilos nos vasos sanguíneos e nos macrófagos na recolha de gânglios linfáticos. A quantidade de MMP-2 e -9 é mais elevada em carcinomas e correlaciona-se com o estádio de Dukes.
2. activador do plasminogénio DeBruin et al. demonstraram que a actividade do activador do plasminogénio do tipo uroquina (uPA) era baixa na mucosa cólica normal, enquanto que a actividade do activador do plasminogénio do tipo tecido (TTPA) era baixa. a actividade do activador do plasminogénio do tipo tPA era alta, mas o oposto era verdadeiro no cancro do cólon, e a actividade no adenoma do cólon estava no meio.
O nível de expressão de uPA foi negativamente correlacionado com o prognóstico, e foi demonstrado que os níveis de proteína de uPA se correlacionam significativamente com a angiogénese tumoral. O receptor do activador fibrinolítico tipo uroquina (receptor uPA, uPAR) é altamente expresso em tumores gastrointestinais humanos, incluindo cancros gástricos, pancreáticos e colorrectais. a expressão uPAR ainda não está completamente elucidada em relação à formação do tumor do cólon. O nível de PAI-1 em activador da enzima fibrinolítica do tipo urokinase-type (inibidor de PAI) tumores está negativamente correlacionado com o prognóstico.
3, a protease serina tipo II ST14/SNC19 foi rastreada em 1993 a partir de uma biblioteca de hibridização meiotica do cancro colorrectal com a capacidade de degradar a matriz extracelular, que estava associada à metástase. Foi também confirmado que os seus substratos de acção são os precursores uPA e HGF/SF (BC-uPA e Pro-HGF/SF), que estão associados à adesão, migração, infiltração e crescimento vascular do tumor. Em estudos de cancro colorrectal, a metástase linfonodal foi elevada naqueles com expressão elevada de ST14/SNC19 na mucosa paracancerosa.
Aplicando a tecnologia Microarray, comparando ST14 antes e depois da transfecção de células RKO, verificou-se que 26 genes relacionados com a metástase eram expressos de forma diferente. Entre eles, 15 eram genes promotores de metástases e 11 inibidores de metástases de células tumorais. A expressão de genes promotores de metástases foi aumentada, tais como factores de crescimento, factores de adesão celular, classes de proteases relacionadas com metástases, moléculas de transdução de sinal e oncogenes.
A expressão de genes inibidores da metástase foi desregulamentada, tais como Maspin e TIMP2. Alterações em todos estes genes podem levar ao aumento da metástase celular. No entanto, cinco dos genes cuja expressão foi desregulada foram genes pró-metastáticos e sete dos genes cuja expressão foi desregulada foram genes supressores da metástase, enquanto que foi possível que a capacidade metastática tenha sido diminuída. O efeito destes sobre a metástase precisa de ser confirmado por outros estudos. A alta expressão do ST14 aumentou a capacidade de migração celular, a capacidade de invasão, promoveu a degradação do ECM, e despolarizou a proteína F-actin do esqueleto por microscopia confocal. Este tipo de alteração foi também confirmado por um elevado ensaio de microarranjo genético.
Os genes cuja expressão foi significativamente aumentada após a expressão da transfecção de SNC19 foram: BRMS1, CSAP8, caveolin-1, CSF1, C-ETS2, ETV4, HPSE, IGF2, KISS1, MGAT5,, CSAP9, H-Ras, ICAM5, KAI1, MMP15, MMP16, MUC1, PIK3. PAI2, TGFA.
Os genes cuja expressão foi significativamente reduzida após a expressão de transfecção SNC19 foram MMP3, MMP7, Maspin, BCSG1, Osteopontin, e TIMP-2.
4. Maspin, um membro da superfamília inibidora da protease serina, foi obtido por hibridação meiótica e exposição diferencial profunda de Ls entre epitélio mamário normal e cancro da mama por Zou et al. em 1994. Aplicando a técnica de visualização diferencial do mRNA, o Instituto de Oncologia da Universidade de Zhejiang descobriu que a expressão da maspin foi aumentada em amostras pareadas de cancros gástricos, e pancreáticos e colorrectais. Na aplicação do estudo de microarranjo genético, verificou-se também que a expressão da maspin foi significativamente elevada em 16 casos de cancro colorrectal, testando 21 pares de amostras emparelhadas de cancro colorrectal e tecidos normais da mucosa. A transfecção antisense de maspin de cancro colorrectal COLO205 mostrou alterações morfológicas de agregação aumentada, maior aderência e morfologia irregular das células cancerosas colorrectais. O estudo mostrou que o gene Maspin está associado à metástase do cancro colorrectal, mas o mecanismo específico da sua acção ainda necessita de mais estudos para ser elucidado.
5.Altered expressão de outras proteases e inibidores de protease A expressão de histone protease D (cathepsina D) afecta a infiltração de células cancerosas. As proteases da histona são principalmente derivadas de células do estroma, tais como os fibroblastos. No cancro colorrectal, a histona D é também expressa em células malignas, mas a relação com o prognóstico não é clara devido à grande variabilidade na sua expressão.
(iii) Factor de crescimento vascular
Há um efeito sinérgico sobre isto. Estes factores podem também estimular o crescimento de células tumorais através da estimulação do mosto autocrino e da secreção parácrina. A produção de vários factores de crescimento vascular é obviamente importante para a rápida proliferação e crescimento infiltrativo de tumores, porque é necessário um fornecimento abundante de sangue para o crescimento tumoral. b) Estimulam a proliferação de células endoteliais vasculares e a produção de outros factores de formação capilar. b-FGF e TGF-b, a (TGF-b e uma célula cancerosa colorrectal podem produzir angiogenina [25]/) factor básico de crescimento fibroblástico (b-FGF) [25], transformando o factor de crescimento
Há cerca de 100 anos, verificou-se que o fornecimento de sangue em tumores era muito mais rico do que nos tecidos normais circundantes, induzidos ou não por células tumorais. 1971 Folkman propôs que o crescimento tumoral depende do fornecimento de sangue e que sem o fluxo sanguíneo, os tumores de oxigénio e nutrientes ficariam em repouso, permaneceriam com 2-3 mm3 de tamanho e depois apoptóticos [26]. Há uma série de membros da família de factores de crescimento vascular, e há a presença de receptor relacionado com o factor de crescimento vascular (VEGFR) na superfície das células tumorais. A ligação deste receptor transmembrana ao VEGF ligante activa a tirosina quinase (TK), o que por sua vez leva à proliferação do endotélio vascular ou/e endotélio vascular linfático.
Entre os membros da família VEGF, VEGF A é o principal mediador da proliferação vascular, e está associado ao VEGF B, C, D e E, e cada um tem associado VEGFR1, 2 e 3 e o factor de crescimento da placenta (PIGF). células endoteliais vasculares linfáticas.
Além de promover a proliferação de células endoteliais, o VEGF pode regular a vagueza das células endoteliais, aumentar a permeabilidade vascular, e modular as respostas imunitárias para regular a proliferação dos vasos linfáticos vasculares. Aparentemente, as células endoteliais vasculares estão envolvidas no desenvolvimento, infiltração e metástase de tumores.
(IV) Outras moléculas relacionadas com a metástase
O gene nm23 foi isolado por Steeg a partir de uma linha celular de melanoma murino com diferente potencial metastásico. nm23 pode regular a proliferação celular através do processo de fosforilação serina. Entre eles, a isoforma nm23-H1 está mais intimamente relacionada com a metástase tumoral [27]. O gene homólogo humano nm23-HI está também localizado no cromossoma 17q21, e esta banda é frequentemente perdida heterozigamente no cancro colorrectal. Foi observado no cancro colorrectal humano que o gene nm23-H1 LOH pode ser um evento tardio na progressão maligna do cancro colorrectal e está estreitamente associado a um comportamento agressivo grave do cancro colorrectal, sugerindo assim que o gene nm23-H1 pode estar envolvido na regulação da progressão maligna e no processo metastático do cancro colorrectal humano [28]. No entanto, à medida que os estudos têm progredido, têm sido tiradas conclusões opostas [29].
2, o gene PRL3 Vogelstein e colegas utilizaram a análise em série da expressão genética (SAGE.) para identificar uma fosfatase das metástases regeneradoras do fígado que foi altamente expressa em todos os 12 cancros do cólon, PRL-3 (fosfatase da regeneração do fígado-3, também conhecida como PTP4A3Proteína tirosina fosfatase tipo IVA3), que não foi expressa no seu tumor primário correspondente do mesmo indivíduo. Pertence a uma nova classe de fosfatases isopreniladas [30].
3. A proteína da ponte óssea (OPN) OPN é uma fosfoproteína glicosilada secretada, que não só está intimamente relacionada com a mineralização do tecido ósseo, mas também com vários fenómenos fisiológicos e patológicos, tais como Ca2+, NO e outros mensageiros celulares, resposta quimiotáxica de macrófagos, proliferação de células musculares lisas, metástases e infecção de tumores, e é considerada como uma nova molécula de sinalização celular [31]. Foi demonstrado que a expressão de OPN é significativamente mais elevada nos tecidos metastáticos do fígado de cancro colorrectal em comparação com o tumor primário [32], e a sua interacção liga-receptor pode desempenhar um papel importante na promoção da metástase hepática do cancro colorrectal. Ding Ling et al. demonstraram que as células tumorais que exprimem Osteopontin tinham reduzido a aderência homogénea e se destacavam facilmente das massas tumorais originais. Em contraste, a capacidade de adesão heterogénea foi aumentada, tal como o aumento da adesão entre as células endoteliais vasculares, que podiam facilmente aderir ao sítio metastásico. A partir da observação imuno-histoquímica, o tecido tumoral e os tecidos hepáticos circundantes foram coloridos positivamente, o que pode estar relacionado com a presença do seu receptor CD44 e integrina em hepatócitos.
A proteína Ras está principalmente envolvida na proliferação celular e na transdução de sinal; a proteína Rab está envolvida na regulação do tráfego intracelular da membrana; a proteína Rho (30% homologia com Ras) desempenha um papel regulador na composição da rede citoesquelética. A proteína Rho (30% homologia com Ras) desempenha um papel regulador na composição da rede citoesquelética, afectando assim a morfologia celular [33]. Foi demonstrado que a sobreexpressão da proteína Rho foi detectada em metástases hepáticas de cancro colorrectal [34]. Verificou-se que defeitos no códão de Ki-ras 12 e o potencial metastático hepático do cancro colorrectal estão intimamente relacionados [35].
Embora mais genes relacionados com metástases hepáticas de cancro colorrectal e eventos moleculares relacionados estejam a ser revelados através dos persistentes esforços dos investigadores. Vogelstein et al. sugeriram que centenas de genes associados ao tumor estão ligados entre si em pequenos “nós” e as suas redes, e os nós estão ligados entre si como um grupo de redes [45]. A ocorrência de metástases hepáticas deve envolver os efeitos sinergéticos ou antagónicos de vários genes e proteínas, e os resultados inconsistentes de alguns estudos têm causado confusão no trabalho de investigação.
V. Biologia molecular e bioinformática da metástase hepática no cancro colorrectal
Cada vez mais cientistas aplicam o ponto de vista da biologia de sistemas para estudar o nível do genoma, o nível de transcrição e o nível de expressão de proteínas como um sistema inteiro para compreender todo o sistema de vida a partir de um nível maior e mais profundo. Para a metástase hepática do cancro colorrectal, o Instituto de Oncologia da Universidade Zhejiang integrou dados de variação do número de cópias cromossómicas para analisar as diferenças dos perfis de expressão genética entre diferentes fenótipos, e estudou a expressão dos genes contidos num segmento específico de cromossomas. E foram realizados os seguintes estudos.
(1) Sete regiões de amplificação cromossómica e seis regiões de eliminação cromossómica foram identificadas na análise CGH de 50 cancros colorrectais primários humanos, entre os quais uma eliminação de alta frequência a 16q não foi relatada da mesma forma. A região 16q20-21 foi analisada por bioinformática para encontrar genes associados à metástase hepática, e posteriormente verificada por métodos biotecnológicos um a um para obter informação relativamente holística.
(2) O microarranjo HG-U95A de AFFYMETRIX foi aplicado para analisar todo o perfil de expressão genómica de 13 casos de tecidos de cancro colorrectal e 12 casos de metástases hepáticas de cancro do cólon, e 9 casos de correspondentes tecidos normais de mucosa colorrectal foram utilizados como controlos. Quando o mesmo algoritmo estatístico de rastreio e o mesmo método de classificação foram utilizados, a integração de dados de variação do número de cópias cromossómicas com dados de microarranjo genético poderia melhorar substancialmente a precisão da classificação tumoral de 36% a 95% e obter um conjunto de genes associados à metástase hepática do cancro colo-rectal.