Os anticorpos anti-fosfolípidos (APA) são um grupo de anticorpos auto-imunes, principalmente anticorpos anti-cardiolipina (ACA) e lúpus anticoagulante (LA), e são um dos principais factores imunitários na perda de gravidez. Estudos têm demonstrado que a medicina chinesa desempenha um papel importante na regulação imunitária. No presente estudo, o efeito de Danshou Tang, uma fórmula para tonificar o rim e revigorar o sangue, na perda de gravidez em ratos grávidos causada pela APA, foi inicialmente observado utilizando experiências em animais. Wei Aiwu, Centro de Reprodução, O Primeiro Hospital Filiado do Colégio Henan de Medicina Tradicional Chinesa
Materiais e métodos
Animais Foram utilizados cento e vinte ratos saudáveis de categoria SPF, fêmeas e machos SD, com 10 semanas de idade, pesando 200g±10g para fêmeas e 250g±20g para machos, fornecidos pelo Centro Experimental Animal da Província de Henan (Certificado de Conformidade n.º 0009881). Ratos fêmeas e machos foram enjaulados juntos à 1:1, e aqueles encontrados com tampões púbicos ou espermatozóides em esfregaço vaginal no início da manhã seguinte foram designados como o dia 0 da gravidez. 100 ratos foram concebidos como os animais experimentais inscritos, e todos os ratos SD foram alimentados num ambiente limpo com temperatura e humidade constantes de 26℃ e 70% de humidade, e 12h de luz/escuridão por dia.
2. drogas A fórmula para tonificar o rim (|Silk Seeds 32 g, Chuanjiao 16 g, Mulberry 16 g, Agaricus 16 g), a fórmula para tonificar o sangue (Salvia 20 g, Radix et Rhizoma 20 g) e Danshou Tang (as duas fórmulas acima combinadas) foram feitas numa decocção concentrada contendo 1 g/ml, 0,67 g/ml e 0,34 g/ml de ervas brutas respectivamente, convertidas de acordo com a relação de peso de ratos humanos. A decocção foi preparada pelo Departamento de Preparação do Primeiro Hospital Afiliado do Colégio Henan de Medicina Tradicional Chinesa.
3. recolha e purificação de soro humano
3.1 Critérios de entrada para a recolha de soro
Pacientes com aborto espontâneo que frequentaram o ambulatório e a enfermaria do Primeiro Hospital Afiliado do Colégio Henan de Medicina Tradicional Chinesa, em Março C de Setembro de 2007, que deram positivo para ACA de sangue por ELISA e médio e elevado por testes quantitativos; pacientes com lúpus eritematoso sistémico (LES) que deram positivo para actividade anticoagulante do lúpus por anticorpos monoclonais no ambulatório e enfermaria durante o mesmo período; soros de indivíduos saudáveis.
3.2 Critérios de exclusão para a recolha de soro
(1) Os doentes com ACA positiva devem ser excluídos de outras causas de aborto; (2) Os doentes com LES, os doentes com ACA positiva e outros anticorpos positivos devem ser excluídos; (3) As três doenças acima referidas, bem como os doentes com uma combinação de várias outras doenças e que não tenham sido recentemente tratados com medicação devem ser excluídos, e o soro deve ser retido com o consentimento do doente.
3.3 Purificação e determinação da concentração da solução proteica Após purificação da solução proteica por salga secundária, a concentração proteica foi determinada por espectrofotometria UV, e o valor OD da solução foi medido a 280nm, referindo-se à fórmula: concentração de massa proteica (mg/ml) = 1,2×OD280nm para encontrar a concentração de massa proteica na solução[1]. A solução foi preparada para uma concentração de massa de 15 mg/ml de solução proteica (equivalente a 75 mg/(kg・d)) e armazenada em porções a -20°C.
A replicação do modelo foi baseada no método de modelação de Holers [2] e modificada. Cada grupo foi dividido em dois grupos de 50 ratos, e cada grupo foi dividido em tónico renal e grupo de activação do sangue (A), tónico renal (B), grupo de activação do sangue (C), grupo modelo (D) e grupo de ratos grávidas em branco (E). Os grupos A, B, C e D receberam injecções subcutâneas de solução proteica purificada ACA e solução proteica purificada LA 15mg/(ml・d) no dia 8 e 12 de gestação respectivamente, enquanto que o grupo E recebeu injecções subcutâneas da mesma quantidade de soro humano normal no dia 8 e 12 de gestação respectivamente. Todos os animais estavam mortos no 15º dia de gestação.
3. indicadores de observação e métodos de exame
3.1 Determinação dos níveis de ACA no sangue de rato 3 ml de sangue foram retirados da aorta abdominal no 15º dia de gestação e os níveis séricos de ACA foram medidos por imunoensaio enzimático e o valor de DO foi medido por instrumento marcado com enzima. (Kit de imunoensaio enzimático ACA, fabricado pela Shenzhen Xaar Biotechnology Co Ltd, lote nº 20070721).
3.2 Determinação da actividade anticoagulante do lúpus por anticorpo monoclonal do sangue murino 1,8 ml de sangue foi retirado da aorta abdominal no 15º dia de gravidez e a sua actividade foi medida pelo método de aglutinação do ponto final usando o tempo de tromboplastina parcial activado (APTT) por referência [3]. (Cronógrafo semi-automático, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ; Mouse monoclonal antibody kit MABTEST, Adiatec SA, Diagnositic }Biotechnologies, LA, France, item número 20070091)
3.3 Pesagem de embriões Após a anestesia Ulatan, os embriões de rato foram separados de coração aberto e pesados molhados usando uma balança electrónica de precisão.
3.4 Determinação da taxa de absorção de embriões A taxa de absorção de embriões foi calculada (taxa de absorção de embriões = número de embriões absorvidos/número de embriões absorvidos + número de embriões não absorvidos × 100%), consultando a literatura [4-5].
3.5 Exame anatomopatológico placentário A porção da placenta desnuda foi fixada com paraformaldeído a 4% durante 24-48h, rotineiramente parafina embutida, seccionada (espessura 4um), coloração HE e coloração imuno-histoquímica SP para grupo modelo de perda de gravidez positiva ACA, coloração HE para grupo modelo de perda de gravidez positiva LA, e aquisição de imagem pelo sistema de análise gráfica médica a cores de alta definição HMLAS-2000.
3.6 Análise estatística O software SPSS 13.0 foi utilizado para análise, e todos os dados foram submetidos ao teste de qui-quadrado, e o teste t foi utilizado para dados entre dois grupos.
Resultados
1. a comparação da taxa de absorção embrionária, peso embrionário, actividade ACA e LA em diferentes grupos de ratazanas grávidas ACA-positivas e LA-positivas é apresentada nas Tabelas 1 e 2.
Em comparação com o grupo D, (1) a taxa de absorção embrionária, os níveis de ACA e APTT foram mais baixos nos grupos A, B e C (P<0,01), mas a diminuição foi significativa no grupo A entre os três grupos (P<0,05), e a diferença não foi estatisticamente significativa com o grupo E. (2) Houve um aumento significativo do peso embrionário nos grupos A e C (P<0,01, P<0,05), e apenas o peso embrionário no grupo A não foi estatisticamente significativo do grupo E (P>0,05). Sugere-se que a fórmula para tonificar o rim e revigorar o sangue é superior à fórmula para tonificar o rim ou revigorar o sangue.
2. observação histopatológica da placenta de rato em cada grupo (1) Secção imuno-histoquímica O grupo E não viu deposição do complexo imunitário castanho ACA; a perda de gravidez ACA Os tecidos placentários do grupo D da placenta de rato podiam ser vistos com diferentes graus de deposição do complexo imunitário ACA castanho, e houve consolidação do núcleo e fragmentação nuclear, sugerindo degeneração e necrose do tecido placentário; os grupos B e C mostraram ambos uma melhoria significativa em comparação com o grupo D; o grupo A não viu degeneração e necrose do tecido placentário O grupo A não mostrou qualquer degeneração ou necrose do tecido placentário. (2) Secções patológicas da placenta O tecido placentário do grupo E estava ordenado com uma estrutura clara e abundantes e uniformes sinusóides sanguíneos; o tecido placentário dos grupos LA e ACA perda de gravidez D apresentava diferentes graus de degeneração e necrose, infiltração de células inflamatórias na camada trofoblasto, e diferentes graus de coagulação de fibrina e estase venosa foram observados nos vasos da placenta, sugerindo uma diminuição da circulação sanguínea placentária; os grupos B e C tiveram ambos uma melhoria significativa em comparação com o grupo modelo, enquanto o grupo A A patologia placentária era basicamente normal no grupo A.
Quadro 1 Alterações na taxa de reabsorção embrionária, peso embrionário e nível de ACA em diferentes grupos de ratazanas grávidas ACA-positivas
Grupo
Número de ratos grávidos
Taxa de captação de embriões
Peso do embrião
Valor de DO de nível ACA
Grupo A
10
0.03±0.03＊*
0.38±0.05＊*
0.10±0.03＊*
Grupo B
10
0.12±0.08＊＊#
0.32±0.06Δ
0.19±0.05＊＊##△
Grupo C
10
0.10±0.04＊＊#
0.29±0.10＊△
0.22±0.04＊＊##△
Grupo D
10
0.21±0.09
0.23±0.04
0.32±0.05
Grupo E
10
0
0.39±0.06
0
Nota: Em comparação com o Grupo D, *P<0.05, **P<0.01; em comparação com o Grupo E, △P<0.01
Em comparação com o grupo A, #P<0.05, ##P<0.01
Quadro 2 Comparação da taxa de absorção embrionária, peso embrionário e actividade LA em diferentes grupos de ratos grávidos LA positivos
Grupo
Número de ratos grávidos
Taxa de captação de embriões
Peso do embrião
APTT(S)
Grupo A
10
0.01±0.03＊*
0.42±0.03＊*
20.03±0.78＊*
Grupo B
10
0.08±0.07＊* #
0.34±0.06Δ
21.40±1.11＊＊ ## △
Grupo C
10
0.06±0.07＊＊ #
0.36±0.06＊△
21.31±1.18＊##△
Grupo D
10
0.19±0.06
0.32±0.04
24.34±1.31
Grupo E
10
0
0.43±0.04
19.86±0.95
Nota: Em comparação com o Grupo D, *P<0.05, **P<0.01; em comparação com o Grupo E, △P<0.01
Em comparação com o grupo A, #P<0.05, ##P<0.01
Discussão
A perda de gravidez manifesta-se frequentemente como aborto recorrente, natimorto ou retardamento do crescimento intra-uterino, etc. Para além de factores genéticos, anatómicos e endócrinos, está estreitamente relacionada com factores imunitários, dos quais a APA é um deles. O mecanismo exacto pelo qual a APA causa a perda de gravidez não é bem compreendido, mas a maioria tende a favorecer a teoria da hemaglutinação. Experiências com animais confirmaram que a APA previne a síntese de prostaciclina, causando um desequilíbrio na relação tromboxano/prostaciclina, levando à hipercoagulação e trombose do sangue, especialmente na circulação placentária, o que pode causar a formação de trombose placentária e enfarte da placenta, resultando em hipoplasia placentária, reabsorção embrionária e atraso do crescimento intra-uterino [6-7]. Aspirina, heparina, prednisona, etc. são principalmente utilizadas em tratamentos clínicos, mas os potenciais efeitos secundários destes medicamentos fazem os pacientes sentir pânico.
Na medicina chinesa, os termos “aborto”, “feto escorregadio”, “atrofia fetal sem crescimento”, e “criança a morrer no abdómen” são semelhantes ao termo médico moderno “perda de gravidez”. Na medicina moderna, é utilizado o termo “perda de gravidez”. De acordo com a medicina chinesa, as doenças acima mencionadas são causadas por danos no Ponto de Perfuração. Os rins são responsáveis pela reprodução e pelo nascimento das crianças. No entanto, se houver uma deficiência de Yang no rim mas sem calor, ou se houver uma deficiência de Yin e calor, o calor queima a essência e o sangue, resultando na estagnação do sangue e falha do sangue, ou se houver repetidos abortos e ferimentos no Punch e Ren, a estase do sangue bloqueia os ligamentos, resultando no deslocamento do feto. No Nei Jing, o “Four Ou Thief Bone and One Roo Pill” abriu o caminho para tonificar o Rim e revigorar o Sangue, e Zhang Xichen salientou que “a Pílula Qi do Rim é um medicamento para tonificar o Rim, mas é também um medicamento para abrir a estase”, acreditando que a combinação orgânica de tonificar o Rim e revigorar o Sangue tem um efeito de reforço mútuo. A fórmula baseia-se no princípio de tonificar o Rim e revigorar o Sangue para acalmar o feto, e é composta pela fórmula Danshou Tang, que é baseada em Shoufei Wan, mais Dangshen e Shenxiang. Nesta fórmula, |Serum seeds e Dan Shen são os governantes, combinando tonicidade e activação para se complementarem; o ministro utiliza Fructus Parviflora e Radix et Rhizoma Polygonati para beneficiar o rim e acalmar o feto, aumentando a função de consolidar e proteger a lavagem e o livre fluxo de sangue; o adjuvante utiliza Radix Aconiti para ajudar Dan Shen a revigorar o sangue e regular o fluxo de sangue; Aconite tonifica o sangue e deixa de sangrar, nutrindo o feto com o sangue, e evita que o sangue disperse o sangue, activando a estase sanguínea. A investigação moderna também demonstrou que |Serum pode promover o aumento da hormona luteinizante ovariana, melhorar a função imunitária humoral e ter efeitos semelhantes aos do estrogénio, inibindo a produção de imunoglobulinas; amora e sequestra são ricas em esteróis e esteróides, que são benéficos para o desenvolvimento do útero e do embrião e inibem o papel da contracção uterina; Agaricus contém uma variedade de oligoelementos, que podem melhorar o capital dos macrófagos para apoiar os coelhos do arquivo senatorial ΓΓ bad Wei Wei zhengdi e que desejam ser. É também conhecida como uma boa fonte de energia para os rins. Os resultados deste estudo mostraram que a fórmula para tonificar o rim e revigorar o sangue era mais eficaz do que a fórmula para tonificar o rim e revigorar apenas o sangue na redução dos títulos de APA, melhorando assim a microcirculação placentária, reduzindo a reabsorção embrionária, aumentando o peso dos embriões de rato, e melhorando a taxa de sucesso das gravidezes repetidas.
Referências.
[1] Lorne E, Lane D. Guia laboratorial de técnicas de anticorpos [M]. Pequim: Science Press, 2002: 9.
Luoen E,laien D. Antibody Technology Experimental Guide [M].Beijing:Science Press,2002:9(Auto-traduzido)
[2] Holers VM, Girardi G, Mo L, et al. A activação do complemento C3 é necessária para a perda fetal antifosfolípida induzida por anticorpos. J. Exp Med, 2002,195(2): 211-20
[3] Chen X-X, Yang C-D, Gu Y-Y, et al. Reconhecimento de outros antigénios fosfolípidos relacionados com o anticorpo fosfolípido através de anticorpos murinos anti-fibrinolíticos e mecanismo patogénico. Chinese Journal of Rheumatology,2006, 10 (6):321-326
Chen Xiaoxiang,Yang Chengde,Gu Yueying,et,al. O estudo experimental sobre anticorpos anti-fosfolípidos induzidos por plasmin.Chin J Rheumatol. 2006, 10 (6) :321-326 :321-326
[4] Zhou YH, Zhu XY, Li DJ, et al. Efeito da intervenção da sinalização costimulatória CD80/CD86 no início da gravidez sobre a expressão de moléculas costimulatórias de células imunoreativas num modelo de aborto espontâneo. Chinese Journal of Immunology, 2004, 20(8):537-543.
Zhou Yue-Hua,Zhu Xiao-yong,LI Da-jin,et al. Efeitos do bloqueio do sinal costimulatório in vivo CD80/CD86 no início da gestação sobre a expressão das moléculas costimulatórias de imumo expressão de moléculas de células imunes ao aborto.Chinese Journal of Immunology,2004,20(8):537-543.
[5] Lin Y, Zeng YY, Zeng SH et al. Toxina macrófaga para reduzir a absorção embrionária em ratos CBA/J×DBA/2. Lin Yi, Zeng Yaoying, Zeng Shan, et al. Journal of Jinan University (Natural Science Edition), 2002, 23(1): 93-98.
Lin YiR,Zeng Yao-ying,Zeng Shan et al. educação da reabsorção embrionária com toxina macrofágica em ratos CBA/J×DBA/2. Lin Yi, Zeng Yao-ying,Zeng Shan, et al. Journal of Jinan University (Natural Science), 2002, 23(1): 93-98.
[6]Piona A,et al. Trombose placentária e perda fetal após transferência passiva de lupusmonoclonal de rato ou anti-cardiolipina policlonal humana anticorpos em ratos BALB/c ingénuos grávidas.Scand J.Immunol.1995:41:427-423.
[7]Ikematsu W,et al. Autoanticorpos monoclonais anticardiolipina humana causam ncrose placentária e perda fetal em ratos BALB/c. Arthritis Rheum.1998:41 Arthritis Rheum. 1998:41 :1026-1039.
[8] Wang ZEM, Fu RZ, Tang ZHANGQuan. Aplicação clínica da medicina tradicional chinesa moderna. Pequim: Editora Saúde do Povo, 2005:259-396
Wang Zaimo,Fu Rongzhou,Tang Zhangquan. Clínica de Medicina Tradicional Chinesa Moderna Aplicável. Pequim :Casa de Punição Médica Popular Pequim :Casa de Punição Médica Popular, 2005: 259-396 (auto-referenciada)