A Pílula de Decocção de Unhas de Tartaruga é do livro “The Essentials of the Golden Horoscope” escrito por Zhang Zhongjing, um médico da Dinastia Han Oriental, e é um remédio para quebrar a estase sanguínea e resolver a catarro, e para ajudar a eliminar o Y. Tem sido relatado ser eficaz no tratamento do cancro do fígado, cancro do esófago, leucemia, fibróides uterinos e assim por diante. A composição da Pílula de Decocção de Unhas de Tartaruga é composta por produtos que decompõem o sangue, resolvem a estase sanguínea e dispersam os nós. Vale a pena explorar seriamente o efeito que estes medicamentos que quebram o sangue, quebram a estase e dispersam os nódulos nos tumores e se promovem a angiogénese tumoral e a metástase tumoral. Utilizámos intervenções herbais in vivo para observar a expressão da contagem microvascular (MDC), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e antigénio nuclear celular proliferante (PCNA) em massas tumorais de ratos portadores de tumores para ilustrar o efeito da pílula de decocção da casca da tartaruga na vasculatura do tumor. 1. materiais e métodos 1.1 Animais experimentais: 60 ratos de raça Kunming, 4-6 semanas de idade, com 18-22 g, machos, adquiridos no Centro Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou. Os ratos foram alojados em gaiolas separadas, alimentados e regados livremente, e os quartos dos ratos foram mantidos ventilados. 1.2 Linha celular: A linha celular era de ascites de ratos – linha celular de carcinoma hepatocelular H22, que podia produzir sarcoma por inoculação subcutânea. As células foram adquiridas no Instituto de Oncologia, Escola de Medicina, Universidade Sun Yat-sen, e foram rotineiramente ressuscitadas e passadas. 1.3 Principais reagentes: anticorpo primário PCNA, anticorpo primário VEGF e kits, todos eles produtos da Wuhan PhD Biological Engineering Co. 1.4 Preparação de medicamentos: decocção de carapaça de tartaruga, fabricado por Hangzhou Hu Qingyutang Co., Ltd, lote número 020602. A decocção de conchas de tartaruga foi preparada em água destilada em duas suspensões contendo 0,048g e 0,024g de droga crua por ml para os grupos de dose alta e baixa respectivamente, armazenada em 4℃ no frigorífico e abanada bem quando utilizada. A ciclofosfamida foi diluída a 2 mg/ml com solução salina estéril e armazenada em 4℃ no frigorífico. 1.5 Estabelecimento de modelo de rato portador de tumores [1]: reanimação in vitro de células H22 cultivadas: fazer a suspensão celular como habitualmente. Ajustados a 2-3×106/ml de células tumorais, 10 ratos saudáveis da raça Kunming foram seleccionados aleatoriamente e cada um foi injectado intraperitonealmente com 0,4ml da suspensão celular acima referida, e o abdómen dos ratos inoculados foi obviamente aumentado e protuberante após cerca de uma semana. As vértebras cervicais foram deslocadas e executadas, fixadas em placas de cera, e o fluido leitoso branco da ascite foi extraído assepticamente, diluído e corado, e a concentração da suspensão celular tumoral foi ajustada para 6×106/ml de células tumorais. 44 ratos foram inoculados subcutaneamente no membro posterior direito de cada rato com 0,2ml. 24 horas mais tarde, a droga foi administrada. 1.6 Agrupamento experimental e administração de droga: Os 44 ratos moldados com sucesso foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de 11 ratos cada e numerados dentro dos grupos. 4 grupos eram: grupo de pílula de decocção de casca de tartaruga, grupo de pílula de decocção de casca de tartaruga, grupo de controlo negativo e grupo de ciclofosfamida. Todos os tratamentos foram iniciados a partir do segundo dia de moldagem: os grupos de dose alta e baixa foram administrados 12g?kg-1?d-1 e 6g?kg-1?d-1 de decocção de carapaça de tartaruga respectivamente por gavagem, o grupo de controlo negativo foi administrado a mesma dose de água destilada por gavagem, e o grupo de ciclofosfamida foi administrado 20mg?kg-1?d-1 por injecção intraperitoneal [2 -1 injecção intraperitoneal[2]. Após 15 dias de dosagem contínua, os ratos foram descontinuados e os blocos tumorais foram removidos após a execução e fixados em formaldeído a 10%. 1.7 Processamento do material extraído: incluindo fixação, desidratação, imersão em cera, revestimento de cera e seccionamento. 1.8 Julgamento dos resultados: contagem de microvasos (MDC) dentro do tumor: o material foi retirado de 5 áreas diferentes dentro do tumor de cada rato portador de tumor, cada bloco era 5mm×5mm×2mm, excluindo a área de hemorragia tumoral e a área de reacção marginal. Para evitar a interferência de vasos maiores, não foram contados vasos com paredes musculares lisas espessas ou áreas luminosas de 8 glóbulos vermelhos. O valor médio é o valor MDC do tumor, nesse caso [3]. O número de células positivas em 100 células tumorais em cada campo de alta magnificação foi calculado e o valor médio foi tomado como o número de células positivas em PCNA [4]. Foi calculada a percentagem de área positiva na área total de células tumorais. 2, Resultados 2.1 Efeito da decocção da casca da tartaruga na contagem microvascular (CDM) do tecido tumoral Como se mostra no Quadro 1: em comparação com o grupo negativo, o CDM tanto do grupo de decocção da casca da tartaruga de alta dose como do grupo de decocção da casca da tartaruga de baixa dose foram significativamente mais baixos (P0.01). Em contraste, não houve diferença significativa entre o MDC do grupo da ciclofosfamida e o grupo de controlo negativo (P>0,05). O MDC do grupo de alta dose do comprimido de decocção de casca de tartaruga foi significativamente inferior ao do grupo de baixa dose do comprimido de decocção de casca de tartaruga (P0.01). O MDC tanto do grupo de alta dose como do grupo de baixa dose de pílula de decocção de carapaça de tartaruga foi significativamente mais baixo, e houve uma diferença significativa quando comparado com o grupo de ciclofosfamida (P0.01). Tabela 1 Efeito da decocção da casca da tartaruga na densidade microvascular (MDC) dos tecidos tumorais ( ) Grupo n Dose inicial (g/kg) MDC (barras) Grupo de controlo negativo 11 11 – 15,7±2,3 Grupo de ciclofosfamida 11 11 20 14,6±2,2 Grupo de alta dose de decocção da casca da tartaruga 11 11 12 4,1±1,2*▲△ Grupo de baixa dose de decocção da casca da tartaruga 11 11 6 7,6±1,4 6 7.6±1.4*△ Nota: Em comparação com o grupo de controlo negativo: *P0.01; em comparação com o grupo de decocção de carapaça de tartaruga: ▲P0.01; em comparação com o grupo de ciclofosfamida: △P0.01 2.2 Efeito da decocção de carapaça de tartaruga no VEGF em tecidos tumorais A expressão do VEGF foi significativamente mais fraca tanto no grupo de decocção de carapaça de tartaruga em dose alta como no grupo de decocção de carapaça de tartaruga em dose baixa do que no grupo de controlo negativo (P0.01). P0.01). A expressão de VEGF foi significativamente mais fraca no grupo de decocção da casca da tartaruga e no grupo de decocção da casca da tartaruga, que foi significativamente diferente do grupo de ciclofosfamida (P0.01, P0.05 respectivamente). A expressão de VEGF foi também significativamente mais fraca no grupo de decocção de casca de tartaruga pílula de alta dose, em comparação com o grupo de decocção de casca de tartaruga pílula de baixa dose (P0.01). Os resultados são mostrados na Tabela 2: Tabela 2 Efeito da decocção da casca da tartaruga no factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) nos tecidos tumorais ( ) Grupo n Dose final inicial (g/kg) VEGF (%) Grupo de controlo negativo 11 11 – 13,18±1,47 Grupo de ciclofosfamida 11 11 20 9,18±3,40* Grupo de alta dose de decocção da casca da tartaruga 11 11 12 2,36± Nota: Em comparação com o grupo de controlo negativo: *P0.01; em comparação com o grupo da ciclofosfamida: △P0.05, △P0.01; em comparação com o grupo da dose baixa: ▲P0.01 2.3 Efeito da decocção da casca da tartaruga na proliferação do antígeno nuclear celular (PCNA) nos tecidos tumorais Como mostra a Tabela 3, a expressão do PCNA A expressão da decocção de conchas de tartaruga foi significativamente enfraquecida tanto nos grupos de alta dose como nos de baixa dose de decocção de conchas de tartaruga, em comparação com o grupo de controlo negativo (P0.01). Em comparação com o grupo da ciclofosfamida, a expressão de PCNA foi significativamente mais fraca tanto nos grupos de altas doses como nos de baixas doses (P0.01). A expressão de PCNA era significativamente mais fraca no grupo de alta dose do que no grupo de baixa dose (P0.01). Tabela 3 Efeito do comprimido de decocção de casca de tartaruga na proliferação de antigénio nuclear (PCNA) em tecidos tumorais ( ) Grupo n Dose inicial (g/kg) PCNA (%) Grupo de controlo negativo 11 11 – 57,45±2,16 Grupo de ciclofosfamida 11 11 20 34,18±2,64* Pílula de decocção de casca de tartaruga grupo de dose elevada 11 11 12 12,90±4,16* △▲ A angiogénese tumoral é um problema difícil de resolver porque envolve muitos aspectos e é difícil de ser eficaz com uma única via de medicamentos. A fórmula foi clinicamente comprovada como eficaz como uma fórmula meridiana, uma vez que consiste em múltiplas drogas com alvos multifacetados, incluindo a regulação do estado funcional global, o ataque a agentes patogénicos localizados, o suporte de energia positiva e a dispersão de massas. A fórmula contém um grande número de drogas que quebram o sangue e dispersam o sangue, tais como Da Huang, Zi Wei, Tu Fu Zi, Dung Beetle, Rattus, Dan Pi e Tao Ren, que quebram a estase sanguínea e dispersam os grumos; Turtle Nail, Han Xia, Scapularia, Wu Fan e Red Nuts, que suavizam a dureza e dispersam os grumos; Bee Hive, que desintoxica e dispersa os grumos; e Scutellaria Baicalensis e Chai Hu, que limpam o calor e dispersam os grumos. Se estas drogas promovem ou inibem a angiogénese tumoral precisa de ser provada experimentalmente. O crescimento tumoral, a infiltração e a metástase requerem o apoio de uma rede capilar nascente. As células tumorais malignas dependem da abundante rede neo-capilar para receberem nutrientes e oxigénio a tempo para o seu crescimento rápido e ilimitado e para transportarem os metabolitos para longe. Durante o crescimento, os tumores podem segregar substâncias que desgastam os vasos sanguíneos e promovem a neovascularização. VEGF é um factor multifuncional que actua especificamente sobre as células endoteliais e tem um papel importante na indução e regulação da angiogénese tumoral. vEGF aumenta a permeabilidade dos vasos sanguíneos, especialmente dos micro vasos [5], e fornece uma rede fibrosa para a migração de múltiplas células durante a angiogénese. vEGF é uma mitogénese de células endoteliais pró-vasculares selectiva [6] que estimula directamente a proliferação das células endoteliais e produz VEGF tem sido utilizado como um indicador prognóstico para reflectir a angiogénese tumoral e determinar a bio-heterogeneidade dos tumores. Nesta experiência, a expressão do VEGF em massas tumorais de ratos portadores de tumores foi detectada por imuno-histoquímica. Os resultados mostraram que a taxa positiva de VEGF tanto nos grupos de alta dose como nos de baixa dose de comprimidos de decocção de casca de tartaruga foi significativamente inferior à do grupo de controlo negativo (P0.01). A expressão de VEGF também foi significativamente mais fraca no grupo de decocção de carapaça de tartaruga em alta dose e no grupo de decocção de carapaça de tartaruga em baixa dose, em comparação com o grupo de ciclofosfamida (P0.01, P0.05 respectivamente). Houve também uma diferença significativa entre o grupo de dose alta e o grupo de dose baixa (P0.01). Isto indica que a expressão de VEGF neste rato portador de tumores foi significativamente inibida pelo comprimido de decocção de casca de tartaruga, e houve uma tendência de efeito quantitativo. O aumento da densidade dos vasos sanguíneos aumenta a hipótese de células tumorais entrarem na circulação, e as células tumorais são mais susceptíveis de atravessar estes vasos e de metástase para locais distantes[7]. Esta experiência mostrou que a contagem de microvasos foi significativamente mais baixa tanto no grupo de alta dose como no grupo de baixa dose da pílula de decocção da casca da tartaruga, o que foi significativamente diferente do MDC do grupo de controlo negativo (P0.01). Em contraste, não houve diferença significativa no MDC do grupo da ciclofosfamida em comparação com o grupo de controlo negativo (P>0,05). O MDC do grupo de alta dose do comprimido de decocção de carapaça de tartaruga foi significativamente inferior ao do grupo de baixa dose do comprimido de decocção de carapaça de tartaruga (P0.01). Isto indica que o comprimido de decocção de casca de tartaruga tem um efeito inibidor sobre a vasculatura tumoral de ratos portadores de tumores. PCNA é uma proteína intranuclear que é expressa juntamente com a proliferação celular. Como marcador de células endógenas proliferantes, a PCNA está intimamente relacionada com a actividade de crescimento, metástase e prognóstico de tumores malignos. A detecção da expressão do PCNA em tecidos tumorais malignos é importante para determinar a malignidade dos tumores, prever a tendência da metástase dos gânglios linfáticos, orientar os protocolos de tratamento clínico, e melhorar o prognóstico dos pacientes [8]. Nesta experiência, a expressão de PCNA nos tecidos tumorais de ratos portadores de tumores foi detectada por imunohistoquímica, e o efeito da pílula de decocção da casca de tartaruga Jingfang sobre o PCNA nos tecidos tumorais foi investigado. Os resultados mostraram que a expressão de PCNA no grupo de dose alta e no grupo de dose baixa da pílula de decocção de carapaça de tartaruga foi significativamente enfraquecida em comparação com o grupo de controlo negativo (P0.01); também foi significativamente enfraquecida em comparação com o grupo de ciclofosfamida (P0.01). A expressão de PCNA no grupo de dose alta foi significativamente mais fraca do que no grupo de dose baixa (P0.01). Estes indicam que a expressão de PCNA neste rato portador de tumores foi significativamente inibida pela decocção da casca da tartaruga, e houve uma certa tendência de efeito quantitativo. 4, Conclusão A decocção de crustáceos e moluscos de tartaruga pode reduzir significativamente a contagem de microvasos de tumor em ratos com tumor, o que indica que a decocção de crustáceos e moluscos de tartaruga pode inibir a angiogénese do tumor em ratos com tumor para alcançar o efeito supressor do tumor. A inibição da angiogénese tumoral pela decocção de conchas de tartaruga pode ser conseguida através da inibição do VEGF tumoral. A inibição da angiogénese tumoral por decocção de casca de tartaruga também pode ser devida à inibição da expressão de PCNA em ratos portadores de tumores.