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O 12º Simpósio Internacional sobre Sindromes Mielodisplásticos (MDS) realizou-se em Berlim, Alemanha, de 8 a 11 de Maio de 2013. O simpósio é realizado de dois em dois anos e centra-se nos resultados da investigação relacionada com as síndromes mielodisplásticas (MDS). O simpósio reuniu especialistas na área do MDS de todo o mundo para discutir questões actuais na área. Ao mesmo tempo, foram apresentados muitos dos últimos avanços da investigação no campo do MDS, abrangendo a biologia, diagnóstico, prognóstico e tratamento do MDS. Liu Xinjian, Departamento de Hematologia, Hospital do Cancro de Henan
Mecanismos moleculares da patogénese do MDS, prognóstico e tratamento epigenético avançam
Mutações do gene MDS
O MDS é um grupo de doenças hematopoiéticas clonais caracterizadas por hemocitopenia, desenvolvimento anormal de uma ou mais linhagens de células mielóides (displasia), hematopoiese ineficaz e um risco aumentado de desenvolvimento de leucemia mielóide aguda (LMA).
(i) uma desordem clonal de origem hematopoiética de células estaminais.
(ii) desenvolvimento anormal de uma ou mais linhas das linhagens de granulócitos, vermelhos e megacariócitos.
(iii) Hematopoiese ineficaz. As manifestações clínicas do MDS são principalmente uma redução na contagem de sangue periférico de uma ou mais linhas e os sinais e sintomas resultantes, com a doença a terminar em falência da medula óssea ou no desenvolvimento de LMA.
Aproximadamente 25-30 mutações envolvidas no desenvolvimento do MDS foram identificadas pela tecnologia de microarranjo de polimorfismo de nucleótido único (SNP) e pela sequenciação de todo o genoma ou exoma. Para além das mutações previamente identificadas em oncogenes, oncogenes e genes codificadores de factores de transcrição, foram recentemente identificadas duas classes principais de mutações, envolvendo genes reguladores-encodificadores epigenéticos e genes codificadores de proteínas complexas de descascamento, respectivamente. Estas mutações podem coexistir em diferentes combinações para diferentes pacientes. Existe uma clara sobreposição entre os genes reguladores-encodificadores epigenéticos no MDS e AML, enquanto que as mutações nos genes codificadores de proteínas do complexo de cisalhamento de RNA são mais comuns no MDS.
As mutações no gene TET2 são amplamente encontradas em malignidades hematológicas tais como MDS (25%), AML (10%), neoplasias mieloproliferativas (MPN, 10%-30%) e leucemia granulocítica crónica (CMML, 50%). A proteína codificada pelo gene TET2 induz a desmetilação, um processo que também requer o envolvimento de iões ferrosos (Fe2+) e α-ketoglutarate (α-KG), um produto de descarboxilação oxidativa de isocitrato catalisado por isocitrato desidrogenase (IDH), e a presença de mutações nos genes IDH1 ou 2 pode inibir a função da proteína TET2; portanto, mutações no gene TET2 e mutações nos genes IDH1 ou 2 são frequentemente As mutações no gene TET2 e nos genes IDH1 ou 2 são, portanto, muitas vezes mutuamente exclusivas. Estudos confirmaram que as mutações de TET2 podem estar associadas a uma terapia eficaz de desmetilação. Além disso, um grande estudo de coorte demonstrou que as mutações do gene EZH2 estão associadas a um mau prognóstico em doentes com MDS. Dos genes encontrados para codificar as proteínas do complexo de cisalhamento SF3B1, SRSF2, U2AF1 e ZRSR2, apenas as mutações em SF3B1 foram fortemente associadas à anemia cíclica por granulocitose de ferro, o principal gene causador deste subtipo, e os pacientes com mutações neste gene tiveram um melhor prognóstico.
Revisão do Sistema Internacional de Pontuação Prognóstica (IPSS-R)
O Sistema Internacional de Pontuação Prognóstica (IPSS) para o MDS foi proposto em 1997 e o Sistema de Pontuação Prognóstica da OMS (WPSS) foi proposto em 2005 com base nos critérios de encenação da Organização Mundial de Saúde (OMS) (2001). Nos últimos anos, os grupos de prognóstico citogenético nestes 2 sistemas foram revistos para
(i) muito bom: eliminação do braço longo do cromossoma 11 [del(11q)], -Y.
(ii) Bom: normal, der(1;7), del(5q), del[12 braço curto (p)], del(20q), 2 anomalias com del(5q).
(iii) moderado: 7q-, +8, i(17q), +19, qualquer outra anormalidade individual ou 2 clones separados.
(iv) Pobres: -7, inv(3)/t(3q)/del(3q), 2 anomalias contendo -7/7q-, 3 anomalias.
⑤ muito pobre: 3 ou mais anomalias.
O WPSS foi revisto em 2011 para alterar se a transfusão de glóbulos vermelhos dependia de anemia grave (<90 g/L em homens e <80 g/L em mulheres). 2012 assistiu à introdução do IPSS-R: as células primitivas foram classificadas por ≤2%, >2% a <5%, 5% a 10% e >10% a 30%; o grupo de prognóstico do cariótipo baseou-se na abordagem de 5 componentes acima mencionada; o refinamento do hematócrito O grupo de risco prognóstico IPSS-R foi dividido em cinco grupos: risco muito baixo, risco baixo, risco intermédio, risco elevado e risco muito elevado, com uma sobrevivência mediana de 6,8, 4,3, 2,3, 1,5 e 0,9 anos, respectivamente, e uma transformação mediana do tempo até à LMA de Não alcançado, não alcançado, 15,7, 4,8 e 2,6 anos respectivamente.
▪ Tratamentos epigenéticos
Os principais tratamentos incluem a metilação do ADN, que pode inibir a expressão dos genes através de modificações da metilação, e a diacetilação do histone, que afecta a actividade transcripcional do ADN ao alterar a estrutura da cromatina, e a diacetilação do histone, que leva ao “silenciamento” dos genes associados à diferenciação celular e inibição do crescimento de tumores devido a alterações epigenéticas no ADN e/ou histones. “Estas alterações epigenéticas são reversíveis, ou seja, podem ser revertidas por inibidores da metiltransferase do ADN (por exemplo, decitabina) e inibidores da deacetilase, e as terapias epigenéticas estão cada vez mais a ser estudadas com grande interesse.
As anomalias epigenéticas são um dos principais mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e evolução do MDS. 2010 mostrou que a metilação do ADN previu a sobrevivência e resposta ao tratamento em doentes com MDS, e um estudo que identificou doentes com MDS com um fenótipo de metilação utilizando o fenótipo de metilação da ilha CpG (CIMP) mostrou que a presença de CIMP estava significativamente associada a um mau prognóstico e risco de transformação leucémica em doentes com MDS. Os níveis de metilação de base não foram significativamente associados à resposta ao tratamento com decitabina, e a duração da redução da metilação foi associada a melhores resultados clínicos. Além disso, estudos têm demonstrado que a decitabina prolonga significativamente a sobrevivência sem progressão (PFS) em doentes com MDS em doentes de risco intermédio a elevado. Um estudo clínico recente da fase II publicado no Journal of Clinical Oncology avaliou a eficácia da decitabina subcutânea de baixa dose em doentes com MDS de baixo e médio risco-1. O estudo incluiu 65 pacientes divididos em 2 grupos e tratados com o regime A (decitabina 20 mg/m2 subcutaneamente nos dias 1, 2 e 3, 1 curso de 28 em 28 dias) e o regime B (decitabina 20 mg/m2 subcutaneamente nos dias 1, 8, 15 e 22, 1 curso de 28 em 28 dias). O tempo médio de seguimento foi de 14,6 meses. Os resultados mostraram que 67% dos pacientes no regime A e 59% no regime B estavam livres da dependência de transfusão de glóbulos vermelhos e plaquetas e aproximadamente 70% dos pacientes sobreviveram até 500 dias.
Avanços no tratamento epigenético da CMML
▪ Situação actual do tratamento CMML
A leucemia monocítica granulomatosa crónica (CMML) combina características das neoplasias mieloproliferativas (MPN) e das síndromes mielodisplásticas (MDS), pelo que a CMML é também definida como uma síndrome de sobreposição MPN/MDS. Os pacientes têm uma diversidade de apresentações clínicas, sobrevivência e testes sanguíneos de rotina. Em geral, os pacientes têm um SO mediano de aproximadamente 20 meses e isto pode estar relacionado com a proporção de células primitivas da medula óssea. 15%-30% dos pacientes com CMML podem progredir para LMC. actualmente, o tratamento para CMML está limitado aos medicamentos anti-proliferativos, que visam apenas o subtipo MPN de CMML. Além disso, embora as anomalias citogenéticas clonais estejam presentes em 20%-30% da CMML, estas anomalias não são específicas da CMML e a maioria dos pacientes apresenta cariótipos normais. Estudos biológicos recentes também não tiveram um impacto eficaz nas opções de tratamento, e não há melhores formas de conseguir uma remissão eficaz nos doentes.
Avanços na terapia epigenética
Um estudo recente apresentado no 12º Simpósio Internacional sobre MDS mostrou que a decitabina é eficaz no tratamento de pacientes com CMML, com taxas de remissão completa (CR) + remissão completa mielóide (mCR) de até 40,5%. Ao mesmo tempo, as taxas de remissão dos pacientes poderiam ser ainda melhoradas aumentando a duração do tratamento com decitabina através da desmetilação sustentada. O estudo incluiu 44 pacientes com CMML administrada decitabina [20 mg/(m2・d) durante 5 dias, a cada 28 dias] durante pelo menos 6 ciclos de tratamento. Após 4 e 6 ciclos de tratamento, os pacientes foram avaliados para remissão de acordo com os critérios do Grupo de Trabalho Internacional (IWG) de 2006. Os resultados mostraram que dos 43 pacientes avaliados de acordo com a classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS), 27 eram do tipo I da CMML e 16 do tipo II da CMML. A idade média dos pacientes era de 71 anos e a duração média do tratamento era de 8 ciclos. Destes, 11 pacientes foram tratados durante <4 ciclos, 17 pacientes durante 4-6 ciclos e 15 pacientes durante >6 ciclos. 81% dos pacientes CMML-I foram tratados durante >4 ciclos. Após 4 ciclos de tratamento, 14% dos casos de CMML eram CR; 18,6% dos casos de CMML eram mCR; 2,3% dos casos de CMML estavam em remissão parcial (PR); e 34,9% dos casos de CMML tinham doença estável (SD). Após 2 ciclos de tratamento decitabina contínuo, a taxa de RC aumentou para 16,2%; a taxa de RCMR aumentou para 24,3%; a taxa de SD diminuiu para 18,9%; e a taxa de RC+ RCMCR atingiu 40,5%. As principais razões para os pacientes interromperem a terapia de decitabina foram a progressão da doença (35%), morte (23%) e reacções tóxicas ao fármaco (7%). Actualmente, 7 (16,3%) doentes ainda se encontram em tratamento. A duração da remissão em pacientes que conseguiram a remissão após 6 ciclos de tratamento foi de 9,7 meses. 7 dos 43 pacientes avaliados tiveram uma infecção grave, um grau 3/4 cardíaco e uma reacção de toxicidade gastrointestinal cada um. A partir deste pequeno estudo de coorte de doentes com CMML, os investigadores não obtiveram características clínicas ou alterações citogenéticas que pudessem prever a remissão da doença nos doentes.
A decisão de tratar pacientes com CMML com decitabina pode ser tomada no artigo de 2007 por Aribi et al em Cancer. O artigo sugere que a decitabina deve ser considerada nas seguintes situações.
(i) A presença de manifestações clínicas de CMML, tais como febre, perda de peso, esplenomegalia, leucocitose e outros sinais e sintomas de grau grave.
(ii) Redução progressiva das células sanguíneas, tais como anemia, trombocitopenia, dependência transfusional.
(iii) CMML envolvendo órgãos, por exemplo, danos na pele, insuficiência renal, sintomas pulmonares.
(iv) Aumento da contagem de células primitivas, com as células primitivas da medula óssea a aumentar para 5% ou 10% ou mais.
▪ Estudos relacionados com as mutações do gene CMML
As anomalias genéticas moleculares estão presentes em 80% dos doentes com CMML, sendo as mutações mais comuns TET2 (58%), SRSF2 (46%) e ASXL1 (40%). Estudos recentes mostraram que as mutações nos genes relacionados com o RNA desempenham um papel importante no desenvolvimento de malignidades mielóides. As mutações no gene SF3B1 são mais comuns (75%-80%) em doentes com MDS com granulócitos de ferro anelados (RS). Em contraste, as mutações no gene de cisalhamento SRSF2 estão principalmente associadas ao CMML. Outro estudo chinês apresentado no 12º Simpósio Internacional sobre MDS para avaliar a frequência das mutações SRSF2 também confirmou que as mutações SRSF2 eram a mutação de cisalhamento predominante em doentes com CMML e estavam associadas a uma idade mais avançada e a um prognóstico mais pobre. O estudo incluiu 20 pacientes com CMML e utilizou a reacção em cadeia da polimerase (PCR) combinada com a sequenciação directa para detectar as mutações. Os resultados mostraram que 11 homens e 9 mulheres, com uma idade média de 62 anos, tiveram mutações SRSF2 em 4 pacientes (20%), mas não mutações SF3B1. Além disso, os investigadores sugerem que a decitabina pode aliviar a anemia e a trombocitopenia em doentes com mutações SRSF2, mas é necessária uma amostra maior.
Vários outros estudos relacionados com a CMML foram apresentados no 12º Simpósio Internacional sobre MDS. Um destes estudos avaliou o papel de matrizes de polimorfismo de nucleótidos únicos (SNP) no diagnóstico e prognóstico de pacientes com CMML de baixo risco. Este estudo mostrou que as matrizes de SNP podem detectar anomalias cromossómicas que não são detectáveis pelos métodos citogenéticos tradicionais. A aplicação deste método a uma série de pacientes poderia ajudar a compreender melhor as características da doença CMML. Além disso, outro estudo concluiu que as células T reguladoras (Tregs) podem ser significativamente elevadas em doentes com CMML com mutações no gene TET2, cujo significado precisa de ser mais explorado. medida que mais investigação for sendo conduzida sobre CMML, o actual estado do tratamento com CMML será gradualmente melhorado.
Estabelecimento de um modelo murino de MDS e a eficácia dos medicamentos desmetilantes
Alterações genéticas moleculares do MDS e estabelecimento de modelos de animais murinos
Com base nas alterações morfológicas e na proporção de células primitivas, os critérios de classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) de 2008 classificam o MDS em: hemocitopenia refratária com anomalias de desenvolvimento unilineares (RCUD), anemia refratária com granulócitos de ferro anelados (RARS), hemocitopenia refratária com anomalias de desenvolvimento multilineares (RCMD), hemocitopenia refratária com proliferação celular primitiva-1 ( RAEB-1, células primitivas 5%-9%), hemocitopenia refratária com células primitivas-2 (RAEB-2, células primitivas 10%-19%), MDS com simples 5q- e MDS não classificável (MDS-U).
Estudos recentes mostraram que a aquisição de múltiplas mutações somáticas herdadas e/ou anormalidades epigenéticas (metilação do ADN, acetilação do historial) em células estaminais hematopoiéticas normais ou células progenitoras leva a uma auto-renovação celular anormal, bem como à diferenciação e maturação, resultando na formação de clones de células estaminais hematopoiéticas malignas que estão subjacentes à patogénese do MDS e do AML. Os eventos moleculares actualmente conhecidos estão centrados em factores de transcrição, vias de transdução de sinal, modificações epigenéticas e microambiente de células estaminais, incluindo TET2, NRAS, KRAS, CBL, ETV6, EZH2, ASXL1, TP53, RUNX1, FLT3, MLL-PTD, WT1, SF3B1 e SRSF2.
As mutações no regulador transcripcional RUNX1 são mais prevalentes em doentes com LMA e MDS (13,1% e 17,5%, respectivamente), e o gene RUNX1 codifica a proteína RUNX1, que se combina com CBFβ para formar um complexo de transcrição do factor de ligação do núcleo que regula a expressão de vários genes relacionados com a hematopoiética. Existem actualmente 2 categorias principais de mutações RUNX1 envolvidas.
(i) as que ocorrem no termo N do RUNX1 (mutação comum RUNX1D171N), principalmente no domínio estrutural RHD, afectando a ligação do RUNX1 ao ADN.
As anomalias dos genes MLL são outra alteração genética comum no MDS e MDS/AML. As proteínas MLL dependem da actividade da metiltransferase para mediar as modificações cromatéricas e assim regular a expressão dos genes associados. Para além dos ectópicos cromossómicos envolvendo MLL, outro tipo de anomalia MLL manifesta-se principalmente como repetições parciais de MLL (MLL-PTD). 7,5% dos pacientes com MLL têm MLL-PTD e 4,2% têm MDS. Estudos demonstraram que tanto a MLL-PTD como a RUNX1 mutações estão frequentemente presentes no momento da progressão da doença em doentes com MDS, com uma maior proporção de mutações coexistentes tanto na LMA primária como na secundária. Isto leva à hipótese de que as mutações RUNX1 e MLL-PTD actuam sinergicamente para causar o desenvolvimento MDS e a transformação AML.
Para confirmar ainda mais esta hipótese, os três modelos animais seguintes de MDS/AML foram construídos em combinação com diferentes mutações RUNX1 em ratos knock-in (knock-in) MLL-PTD.
(i) modelo MLL-PTD/RUNX1-/-.
(ii) MLL-PTD/RUNX1- D171N modelo BMT.
③MLL-PTD/RUNX1- 291fs modelo BMT. Primeiro, Mx1-Cre foi aplicado e o alelo RUNX1 foi eliminado em ratos knock-in MLL-PTD. 1 mês após a indução de pIpC, os ratos PTD/RUNX1-/- mostraram hipoplasia plaquetária significativa, e 2-4 meses depois, anemia macrocítica e leucocitopenia. A análise morfológica da medula óssea e do sangue periférico revelou alterações características de desenvolvimento anormal da granulosa, eritrócitos e linhagens de megacariócitos. A maioria dos ratos PTD/RUNX1-/- morreu no prazo de 8 meses, com uma sobrevivência média de 149 dias. A seguir, foram estabelecidos modelos de ratos transplantados através da construção dos plasmídeos retrovirais RUNX1D171N e RUNX1s291fs e células de medula óssea de ratos de tipo selvagem (WT) e MLL-PTD knock-in. Para além da anemia macrocítica, trombocitopenia e anomalias morfológicas, a medula óssea dos ratos transplantados mostrou frequentemente um aumento de células primitivas (particularmente nos ratos transplantados MLL-PTD/RUNX1-291fs), e os transplantes seriais de medula óssea mostraram que o fenótipo da doença MLL-PTD/RUNX1-291fs era transplantável, mas não sofreu transformação AML.
Eficácia dos medicamentos desmetilantes
Estudos anteriores mostraram que vários genes estão hipermetílicos em doentes com MDS, e como resultado, a US Food and Drug Administration (FDA) aprovou os inibidores da metilação transferase 5-azactidina e 5-azido-2′-deoxictidina (decitabina) para o tratamento do MDS. Esta última inverte a aberrante hipermetrotilação das citosinas nas ilhas CpG de ADN e reactiva genes supressores de tumores que foram geneticamente “silenciados” devido à hipermetrotilação, exercendo assim efeitos supressores de tumores. Os ensaios clínicos demonstraram que a decitabina é eficaz em MDS e MDS/AML de risco intermédio e elevado, com taxas de eficácia que variam entre 30% e 73%. Utilizando um ensaio Dot Blot, os investigadores examinaram a expressão de 5-mc e 5-hmc no lin-Kit de murino transplantado MLL-PTD/RUNX1-291fs, e mostraram que, em comparação com o grupo de controlo, a expressão de 5-mc no lin-Kit de murino transplantado MLL-PTD/RUNX1-291fs foi significativamente melhorada, sugerindo que os seus níveis de metilação de ADN foram aumentados. A sobrevivência de ratos transplantados MLL-PTD/RUNX1-291fs tratados com decitabina de baixa dose (0,3 mg/kg, subcutaneamente duas vezes por semana) foi significativamente mais longa do que a de ratos de controlo salino [(94,5±6,4) dias versus (53,5±3,5) dias, P<0,001]. As células da medula óssea murina transplantadas MLL-PTD/RUNX1-291fs foram cultivadas numa série de colónias in vitro e tratadas com decitabina (0,5 μM), o que mostrou uma redução significativa do número de colónias no grupo tratado com decitabina (34±7,7 versus 619±30,5, P<0,001) e promoveu a diferenciação celular; contudo, para as células iniciais do MDS (MICs), o efeito da decitabina por si só foi limitado. No entanto, para as células iniciais do MDS (MICs), a decitabina por si só teve um efeito limitado e não conseguiu reduzir significativamente o número de MICs e a capacidade de formação de colónias, o que pode ser um possível mecanismo de resistência clínica à decitabina.
Em conclusão, o estabelecimento de um modelo de rato do MDS não só contribui para o estudo da patogénese do MDS, como também fornece uma ferramenta útil para a implementação de novas estratégias terapêuticas para o MDS. Além disso, embora o tratamento com doses baixas de decitabina possa prolongar a sobrevivência dos ratos transplantados MLL-PTD/RUNX1-291fs, promovendo a diferenciação celular, a decitabina por si só tem uma eficácia limitada nos MIC, e a combinação adicional com outros medicamentos para visar os MIC pode melhorar a eficácia. Fonte: China Medical Tribune