VEGFR-3, também conhecido como Flt-4, que actua como receptor de tirosina quinase para VEGF-C/D, é expresso em sinusóides do fígado e do baço, reparação do trauma e no endotélio vascular nascente do tecido tumoral, para além de ser expresso principalmente em células endoteliais dos vasos linfáticos. Ma Xiaoping, Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, Hospital Provincial de Medicina Integrativa de Jiangsu Descobertas recentes sugerem que a expressão VEGFR-3 também está presente nas próprias células tumorais e está envolvida na progressão de tumores malignos de várias formas. Neste estudo, a expressão do VEGF-C, VEGF-D e VEGFR-3/Flt-4 nos tecidos iniciais do cancro do colo do útero foi detectada pelo método imunohistoquímico SP, e o VEGFR-3/Flt-4-densidade vascular (MVD) também foi detectado para analisar a sua relação com factores clinicopatológicos e para investigar o papel do VEGFR-3/Flt-4 no processo de progressão no cancro precoce do colo do útero. Foi investigado o papel do VEGFR-3/Flt-4 na progressão do cancro do colo do útero em fase inicial. 1. materiais e métodos 1.1 Foram seleccionados 41 casos de tecidos de cancro do colo do útero cirurgicamente ressecados, fixados em paraformaldeído a 4% e embebidos em parafina. Os tecidos não foram tratados com radioterapia antes da cirurgia e foram patologicamente confirmados após a cirurgia. A fase clínica foi de acordo com a norma da Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO, 2000), incluindo 7 casos da fase Ia, 14 casos da fase Ib e 20 casos da fase IIa; classificação histológica: G17 casos, G2 13 casos, G3 21 casos; tipo histológico de carcinoma escamoso celular 37 casos, adenocarcinoma 4 casos; 15 casos com metástase linfonodal, 26 casos sem metástase linfonodal; a idade dos doentes variou entre os 26 e os 70 anos, idade média 42 A idade média era de 42 anos, 12 casos eram pós-menopausa e 29 casos eram pré-menopausa. As células cancerígenas foram encontradas infiltradas linfáticas na luz dos vasos linfáticos sob microscopia. 35 casos não tinham infiltrados linfáticos e 6 casos tinham infiltrados linfáticos. 1.2 Métodos de estudo 1.2.1 Coloração imuno-histoquímica SP O kit imuno-histoquímico SP foi utilizado e operado estritamente de acordo com as instruções. Os blocos de cera de tecido foram seccionados em série em 5μm; o xileno foi rotineiramente desparafinado e hidratado; a reparação térmica do antigénio de microondas (95℃,10min), a solução de reparação do antigénio foi tampão citrato (pH 6,0); a peroxidase endógena foi bloqueada por 3% de solução de peróxido de hidrogénio e metanol durante 10min; 10% de soro de cabra foi utilizado para bloquear anticorpos não específicos; anticorpo primário: anticorpo policlonal de coelho anti-humano VEGF-C (1:50. ZA-0266); anticorpo policlonal anti-coelho anti-humano VEGF-D (1:100, BA1461); anticorpo policlonal anti-coelho VEGFR-3 (1:200, ab27278), incubar durante 60min; adicionar anticorpo secundário biotinilado anti-coelho gota-a-gota, incubar durante 30min; adicionar afinidade de cadeia de peróxido de rábano gota-a-gota, incubar durante 30min; desenvolvimento microscópico DAB, hematoxilina O tampão PBS foi utilizado como controlo negativo em vez de anticorpos primários, e as secções conhecidas do cancro da mama foram utilizadas como controlo positivo. 1.2.2 Determinação dos resultados A coloração positiva para VEGF-C, VEGF-D e VEGFR-3/Flt-4 foi definida como a presença de grânulos amarelo-acastanhados no citoplasma. De acordo com o método relatado por Jüttner et al. a percentagem de células positivas foi dividida em: – (sem células positivas), + (0-5% células positivas), +++ (5%-50% células positivas), ++++ (>50% células positivas). O MVD foi determinado pelo método relatado por Weidner et al. A área densa de lúmens positivos, ou seja, a área do “ponto quente”, foi procurada sob baixa ampliação, observada e contada sob alta ampliação, e o MVD foi expresso como o número médio de lúmens positivos em cinco campos de alta ampliação. 1.3 Tratamento estatístico Todos os dados foram processados utilizando o software estatístico SPSS13.0. Os dados de medição MVD foram expressos como ± s. P<0,05 foi considerado uma diferença estatisticamente significativa. 2. resultados 2.1 Expressão do VEGFR-3 em tecidos de cancro cervical em fase inicial VEGFR-3/Flt-4 foi expressa em células endoteliais de vasos linfáticos, para além de algumas células endoteliais vasculares. Morfologicamente, VEGFR-3/Flt-4 vasculatura positiva é parcialmente vascular e parcialmente linfática. Algumas das células inflamatórias em redor da vasculatura positiva também mostraram expressão proteica VEGFR-3/Flt-4 (Figura 1A), e VEGFR-3/Flt-4 vasculatura positiva foi encontrada principalmente no interstício em redor do tecido tumoral (Figura 1B). Verificou-se que algumas das vasculaturas VEGFR-3/Flt-4 positivas continham células cancerígenas (Figura 1C). A expressão das proteínas VEGF-C, VEGF-D e VEGFR-3/Flt-4 foi observada nas células tumorais, e as suas taxas de expressão positiva foram 48,7% (20/41), 58,5% (24/41) e 63,4% (26/41), respectivamente (Figura 1D, E e F). Figura 1 Expressão de VEGFR-3/Flt-4 em tecidos de cancro do colo do útero em fase inicial 2.2 Relação entre proteína VEGFR-3/Flt-4, MVD e factores clinicopatológicos e expressão de proteína relacionada em tecidos de cancro do colo do útero em fase inicial VEGFR-3/Flt-4 não estava relacionada com o estado menstrual, grau histológico e tipo histológico de doentes com cancro do colo do útero, e não estava relacionada com a fase clínica, metástase linfonodal A MVD não estava relacionada com o estado menstrual, grau histológico, tipo histológico, metástase linfonodal e infiltração vascular linfática, mas estava relacionada com a fase clínica e as proteínas VEGF-C e D. Quadro 1 Relação entre VEGFR-3/Flt-4 e MVD e factores clinicopatológicos e expressão das proteínas VEGF-C e D nos tecidos iniciais do cancro do colo do útero 3. Discussão Devido às suas propriedades pró-angiogénicas ou pró-lymphangiogénicas, a família VEGF-A, B, C, D e E do factor de crescimento endotelial vascular e os seus receptores VEGFR-1, -2 e -3 desempenham um papel na promoção do crescimento e metástase de tumores malignos O papel do VEGF-A, B, C, D, E e dos seus receptores VEGFR-1, -2 e -3 na promoção do crescimento de tumores malignos e metástases e as correspondentes estratégias de terapia genética têm sido um tema quente de investigação. Estudos actuais sugerem que a angiogénese tumoral é principalmente regulada pelo VEGF-A/VEGFR-2, enquanto que a linfangiogénese tumoral é principalmente regulada pelo VEGF-C e D/VEGFR-3. Os resultados deste estudo mostraram que o VEGFR-3/Flt-4 foi expresso em células endoteliais vasculares linfáticas, mas também em algumas células endoteliais vasculares. A morfologia da vasculatura positiva VEGFR-3/Flt-4 foi parcialmente vascular e parcialmente linfática, e a densidade vascular MVD positiva VEGFR-3/Flt-4 marcada correlacionada com a fase clínica e as proteínas associadas VEGF-C e D, mas não com outros factores clinicopatológicos tais como o estado menstrual e o grau histológico. Isto difere das conclusões de Yasuoka et al. O mecanismo pode ser que o VEGFR-3/Flt-4 desempenhe um papel regulador importante tanto na linfangiogénese tumoral como na angiogénese. As células tumorais secretam VEGF-C e D, que actuam como receptores parácrinos nos receptores de tirosina quinase VEGFR-3/Flt-4 nas células endoteliais dos vasos linfáticos ou células endoteliais vasculares, mediando a proliferação de células endoteliais, diferenciação e formação de lúmen. Por um lado, o aumento dos vasos sanguíneos no tecido tumoral fornece os nutrientes necessários para o crescimento das células tumorais e, por outro lado, o aumento dos vasos linfáticos no tecido tumoral fornece canais para a infiltração e metástase das células tumorais, facilitando a sua propagação metastática. No entanto, devido à falta de verdadeiros marcadores endoteliais dos vasos linfáticos, os marcadores celulares endoteliais dos vasos linfáticos em diferentes tipos, localizações e mesmo diferentes fases de desenvolvimento nos tecidos são diferentes, pelo que o mecanismo exacto do papel do VEGFR-3/Flt-4 na angiogénese tumoral e geração de vasos linfáticos precisa de ser estudado em profundidade. Para além do VEGFR-3/Flt-4 como receptor para VEGF-C/D, que se expressa principalmente em células endoteliais, descobertas recentes sugerem que muitas células tumorais também expressam Flt-4 e desempenham um papel importante na progressão dos tumores. Em estudos clínicos de muitas malignidades humanas, a expressão de VEGFR-3/Flt-4 em células tumorais demonstrou estar correlacionada com a fase clínica, o grau de diferenciação celular, a metástase dos gânglios linfáticos e o prognóstico do paciente. Por conseguinte, é possível que esteja envolvido na transformação do fenótipo pro-lymphangiogénico durante a carcinogénese cervical. Os resultados dos estudos de migração in vitro e ensaio de invasão mostraram que certas células tumorais com forte capacidade invasiva, tais como a linha de células cancerosas do colo do útero SiHa, a linha de células cancerosas da mama MDA-MB-231 e Hs578T, expressam Flt-4 para além da proteína VEGF-C. O corpo humano recombinante VEGF-C (Cys156Ser) foi capaz de promover a migração e a capacidade invasiva das células tumorais. Masood et al. mostraram que o VEGFR-3/Flt-4 também pode estar envolvido na proliferação, sobrevivência e desenvolvimento químico de células de leucemia. sobrevivência e formação de quimiorresistência. No presente estudo, a expressão do VEGFR-3/Flt-4 nas células tumorais correlacionou-se com metástases linfonodais, infiltração linfovascular e fase clínica dos pacientes nos tecidos cancerosos do colo do útero, e com a expressão dos seus ligandos VEGF-C e proteínas D. O mecanismo pode ser que as células tumorais segregem VEGF-C e D, que actuam sobre VEGFR-3/Flt-4 nas próprias células tumorais de forma autocrítica, promovendo a migração e infiltração de células tumorais, levando assim à infiltração de vasos linfáticos tumorais e à metástase de gânglios linfáticos e participando na progressão tumoral. Os resultados do estudo de Jüttner et al. concluíram que a expressão de VEGFR-3/Flt-4 em células cancerosas gástricas não estava associada à metástase dos gânglios linfáticos nos doentes. metástase dos gânglios linfáticos nos doentes. Além disso, os resultados deste estudo mostraram que a expressão da proteína VEGFR-3/Flt-4 também foi observada em algumas células inflamatórias no interstício que rodeia o tecido tumoral, mas o seu papel não é claro. Foi demonstrado que as células inflamatórias no interstício do tecido tumoral também podem desempenhar um papel importante no processo de linfangiogénese tumoral. Podemos assim especular que o papel do VEGFR-3/Flt-4 na progressão de malignidades cervicais pode ser multifacetado e pode variar entre tipos de tumores, e o mecanismo exacto permanece por investigar mais profundamente.