Investigar o mecanismo dos efeitos anti-inflamatórios e anti-adesivos dos grânulos inflamatórios pélvicos sobre a doença inflamatória pélvica crónica em ratos causada por bactérias mistas mais a estimulação mecânica. MÉTODOS: O modelo da doença inflamatória pélvica crónica do rato foi replicado por um método misto de estimulação bacteriana e mecânica e aleatoriamente dividido em grupo normal, grupo modelo, grupo operado por sham-operated, grupo de pellet inflamatório pélvico e grupo de pellet inflamatório pélvico de dose alta, média e baixa.
Resultados: As pastilhas inflamatórias pélvicas reduziram significativamente os níveis séricos IL-1β, IL-8 e MCP-1 e aumentaram significativamente o nível sérico IL-10 nos ratos modelo, e os níveis nos grupos de dose alta e média estavam próximos dos do grupo normal. Conclusão: O mecanismo dos efeitos anti-inflamatórios e anti-adesivos dos grânulos inflamatórios pélvicos nos ratos modelo pode ser a redução dos níveis de factores pró-inflamatórios séricos e quimiocinas, ao mesmo tempo que aumenta os níveis de factores anti-inflamatórios, restabelecendo assim o equilíbrio dos factores inflamatórios e reduzindo as reacções inflamatórias locais e a fibroplasia.
Grânulos inflamatórios pélvicos; doença inflamatória pélvica crónica; citocinas inflamatórias; quimiocinas
A doença inflamatória pélvica crónica é uma doença comum e frequente em ginecologia, caracterizada por dor abdominal, hipocondriose, espessamento dos tecidos pélvicos, aderências e formação de massa, e é frequentemente recorrente e persistente. No presente estudo, os efeitos dos grânulos inflamatórios pélvicos nas citocinas inflamatórias do soro e quimiocinas em ratos foram investigados com base no estudo experimental anterior, a fim de explorar o mecanismo dos efeitos anti-inflamatórios e anti-adesivos da circulação sanguínea e do método tónico renal.
1. materiais e métodos
1. 1 Animais experimentais
Setenta ratos fêmeas saudáveis não riscados SD. Peso corporal 180-220g, fornecido pelo Animal Experiment Center da Universidade de Shandong, número de licença: SCXK LU20030004.
1. 2 Drogas experimentais
Os grânulos inflamatórios pélvicos (Salvia miltiorrhiza, Radix Paeoniae, Semen Cuscutae, Radix Pulsatillae, Fritillariae, Forsythiae, etc.) foram fornecidos pelo Departamento de Preparação do Hospital Filiado da Universidade de Shandong de Medicina Tradicional Chinesa; os grânulos inflamatórios pélvicos (Lonicerae, Gynostemma, Yimou, Chuanxiong, Espinha de Cão, etc.) foram produzidos pela Kunming Jaeda Pharmaceutical Co. N.º 003301.
1. 3 Reagentes experimentais
Tensão: Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Streptococcus haemolyticus B foram dissolvidos em solução salina estéril na proporção de 2:1:1 para formar uma suspensão bacteriana mista com uma concentração de 15×109/mL, que foi fornecida pela sala de estirpes da Estação Provincial de Saúde e Prevenção de Epidemias de Shandong. Foram adquiridos kits de imunoensaio enzimático de interleucina-1β (IL-1β), interleucina-8 (IL-8), interleucina-10 (IL-10) e proteína quimiotática monocitária-1 (MCP-1) da ADL, EUA.
1. 4 Métodos experimentais
1. 4. 1 Modelo de replicação Os ratos foram aclimatados durante 3 dias e depois moldados no dia 4 por injecção bacteriana mista. Após a injecção intraperitoneal de sódio pentobarbital (concentração 0,4%) para anestesiar os ratos (50mg/kg), foi feita uma incisão de 0,8-1cm no abdómen médio inferior em condições assépticas, e o útero foi exposto e fixado após a abertura do abdómen. 0,2mL de suspensão bacteriana mista foi extraído com uma seringa de 1mL. No grupo operado com uma farsa, o abdómen foi aberto após anestesia, e 0,1mL de água de injecção estéril foi injectada em cada lado do útero e o abdómen foi fechado.
1. 4. 2 Agrupamento e administração de drogas Oito ratos foram seleccionados aleatoriamente entre 65 ratos como o grupo normal, e os restantes 52 ratos participaram na moldagem, dos quais oito ratos foram seleccionados aleatoriamente como o grupo operado por uma farsa. Os restantes ratos foram criados durante 14 dias após o processo de modelagem e divididos aleatoriamente em grupo modelo, grupo de doença inflamatória pélvica de dose elevada, grupo de doença inflamatória pélvica de dose média, grupo de doença inflamatória pélvica de dose baixa e grupo de rede de doença inflamatória pélvica.
O grupo de tratamento recebeu pellets inflamatórios pélvicos durante 2 semanas. O grupo de tratamento recebeu uma preparação de granulado inflamatório pélvico (100mg/mL) a 2g/kg para o grupo de dose alta, 1g/kg para o grupo de dose média e 0,5g/kg para o grupo de dose baixa; o grupo de rede inflamatória pélvica recebeu uma preparação de granulado inflamatório pélvico (54mg/mL) por gavagem a 540mg/kg para cada rato. 2mL de soro fisiológico foi dado ao grupo modelo por gavagem e o grupo normal foi mantido normalmente sem qualquer tratamento. O grupo normal foi mantido normalmente sem qualquer tratamento. Os ratos foram administrados uma vez por dia durante 14 dias.
Após 24h da última dose, os animais foram fixados e 3~4mL de sangue foi retirado do coração, centrifugado (3000r/min) durante 10min e o sobrenadante foi separado e armazenado abaixo de -30℃. As concentrações de citocinas IL-1, IL-8, IL-10 e MCP-1 no soro foram determinadas pelo ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) em estrita conformidade com as instruções de funcionamento do kit. O útero foi removido de ambos os lados e fixado em fixador de formalina a 10%, e as alterações histomorfológicas do útero foram observadas sob secção convencional, coloração HE e microscopia luminosa.
1. 4. 4 Métodos estatísticos Os resultados foram analisados estatisticamente pelo software SPSS 16. 0, utilizando o teste ANOVA e q de uma via para comparação entre grupos.
2. RESULTADOS
2. 1 Efeito das pastilhas inflamatórias pélvicas no nível sérico IL-1βIL-10 dos ratos modelo
Os resultados experimentais mostraram que o nível de IL-1β aumentou significativamente (P<0. 01), enquanto que o nível de IL-10 diminuiu significativamente (P<0. 01) nos ratos modelo em comparação com o grupo normal. Todos os grupos de dose de pastilhas inflamatórias pélvicas podiam reduzir o nível de IL-1β e aumentar o nível de IL-10 em diferentes graus, e os grupos de dose média e alta estavam próximos do nível normal (P>0. 05). O nível de IL-1β no grupo dos grânulos inflamatórios pélvicos de dose elevada foi significativamente inferior ao do grupo dos grânulos inflamatórios pélvicos (P<0. 05). Ver quadro 1.
Quadro 1 Efeito das pastilhas inflamatórias pélvicas no soro IL-1β níveis de IL-10 em ratos modelo (pg/mL),
±s)
Grupo
n
IL-1β
IL-10
Grupo de controlo normal
8
35.73±4.43??
42.43±4.48??
Grupo modelo
8
45.88±4.93※※
27.35±2.99※※
Grupo de operação fraudulenta
8
36.43±3.74?
41.23±4.68?
Grupo de medicamentos inflamatórios pélvicos
8
41.01±3.69? O grupo das drogas inflamatórias pélvicas
36.75±3.87?
Doença inflamatória pélvica grupo de alta dose
9
36.49±3.09? ? △
39.32±4.00?
Doença inflamatória pélvica grupo de dose média
9
38.82±2.44? ?
39.97±3.81?
Doença inflamatória pélvica grupo de baixa dose
9
40.58±3.61?*?
35.71±3.72※※?
Nota: Em comparação com o grupo de controlo normal,*P<0. 05,**P<0. 01; em comparação com o grupo modelo,*P<0. 05,*? P<0. 01; em comparação com o grupo de pellets inflamatórios pélvicos, △P<0. 05, △△P<0. 01; o mesmo abaixo.
2.2 Efeito do granulado no nível sérico IL-8MCP-1 dos ratos modelo
Os resultados experimentais mostraram que os níveis de IL-8 e MCP-1 nos ratos modelo eram significativamente superiores aos do grupo normal (P<0. 01), e todos os grupos de dose de Granulado Inflamatório Pélvico podiam reduzir os níveis de IL-8 e MCP-1 a diferentes graus, enquanto que os grupos de dose média e grande estavam próximos do nível normal (P>0. 05), e o grau de efeito estava relacionado com a dose. O nível de efeito dos grânulos inflamatórios pélvicos nos grupos de dose média e alta reduziu significativamente os níveis de IL-8 e MCP-1 em comparação com o grupo de grânulos inflamatórios pélvicos (P<0. 05 ou P<0. 01). Ver quadro 2.
Quadro 2 Efeito dos grânulos inflamatórios pélvicos nos níveis séricos de IL-8 MCP-1 em ratos modelo (pg/mL).
±s)
Grupo
n
IL-8
MCP-1
Grupo de controlo normal
8
22.47±1.96? ?
19.04±1.89?
Grupo modelo
8
31.50±2.67※※
26.05±2.27※※
Grupo de operação fraudulenta
8
22.57±2.98?
18.08±1.82?
Grupo de medicamentos inflamatórios pélvicos
8
25.87±2.45? O grupo das drogas inflamatórias pélvicas
22.90±2.02? ※※
Doença inflamatória pélvica grupo de alta dose
9
21.14±2.96? △△
20.66±1.66? △△
Grupo de dose média inflamatória pélvica
9
23.22±2.11? △
21.63±1.68?
Doença inflamatória pélvica grupo de baixa dose
9
27.00±3.32※※? ?
24.37±2.07※※?
Nota: Em comparação com o grupo de controlo normal,*P<0. 05,**P<0. 01; em comparação com o grupo modelo,?P<0. 05,? P<0. 01; em comparação com o grupo da rede inflamatória pélvica, △P<0. 05, △△P<0. 01; o mesmo abaixo.
3. discussão
Tem sido sugerido que algumas das doenças inflamatórias pélvicas crónicas estão livres de agentes patogénicos durante o processo de desenvolvimento crónico e que as alterações patológicas na fase crónica são devidas à resposta imunitária após a infecção bacteriana e estão relacionadas com alterações anormais de factores imunitários tais como citocinas relevantes, mediadores inflamatórios, radicais livres e células apoptóticas. As citocinas pró-inflamatórias, tais como a interleucina-1, IL-8 e a necrose tumoral de factor-alfa, e as citocinas anti-inflamatórias, tais como a interleucina-4, IL-10 e a transformação do factor de crescimento-beta, podem ser classificadas em dois grupos principais de acordo com as suas funções. As citocinas pró-inflamatórias podem promover o desenvolvimento de inflamação, enquanto as citocinas anti-inflamatórias podem inibir a resposta inflamatória e promover a reparação e regeneração dos tecidos. O equilíbrio entre os dois influenciará o desenvolvimento e o resultado do trauma e da inflamação dos tecidos.
A IL-1 é um factor mononuclear, uma das principais citocinas secretadas por macrófagos, e é um dos iniciadores da inflamação. A IL-1β pode promover ainda mais a libertação de factores inflamatórios activando neutrófilos e células endoteliais, e produzir metabolitos tais como radicais de oxigénio, proteases e ácido araquidónico, resultando num efeito de cascata que causa danos às células endoteliais.
A proteína quimiotáxica monocitária-1 (MCP-1) e a IL-8 são ambas quimiocinas e factores pró-inflamatórios. A IL-8 é um forte factor quimiotáctico neutrofílico, pertencente à classe C-C de quimiocinas, que promove a libertação de lisossomas e partículas negativas superóxidas, leucotrienos e 5-hidroxitriptamina a partir dos neutrófilos, e aumenta a sua capacidade de viajar, aumentando a expressão das moléculas de adesão de monócitos; ao mesmo tempo, a IL-8 é um factor pró-inflamatório, e os neutrófilos sofrem alterações morfológicas no contacto com a IL-8, o que leva à libertação de uma série de produtos activos no local de reacção, resultando em inflamação local. IL-10 é uma classe muito importante de neutrófilos.
A IL-10 é um factor anti-inflamatório endógeno muito importante, produzido principalmente por células T, e é um membro chave do ciclo de feedback negativo da inflamação, o que tem o efeito de reduzir a sobre-activação das células inflamatórias. inibir a proliferação de células Th monocitárias e suprimir a síntese e actividade de citocinas do tipo Th1, especialmente a produção de interferão (IFN-γ). Descobriu-se que a IL-10 desregula a expressão de factores inflamatórios inibindo a actividade da IκB kinase e prejudicando a capacidade do factor nuclear-κB (NF-κB) de se ligar a sítios específicos de ADN.
A IL-1 tem uma vasta gama de efeitos na actividade angiogénica das células endoteliais, proliferação de fibroblastos e síntese de colagénio; a IL-1 é libertada após trauma e liga-se aos receptores para promover a proliferação epidérmica e fibroblastos e a síntese de colagénio por meios autócrinos e parácrinos. Mulayim et al. mostraram que a IL-8 aumentou a actividade das MMPs em células do estroma endometrial (ESCs) cultivadas in vitro e aumentou a sua capacidade invasiva.
A IL-8 também induziu a adesão das células endometriais à fibronectina, e a adesão das células endometriais à fibronectina e à expressão da IL-8 induzida pelo colagénio, que por sua vez se promoveram mutuamente e contribuíram ainda mais para o desenvolvimento da inflamação peritoneal. A IL-l0 inibe a progressão da fibrose, provavelmente porque a deficiência de IL-10 uprega a síntese de colagénio do tipo I e promove a expressão do gene da colagenase para remodelar a matriz extracelular, e também impede a produção do factor pró-fibrótico TGF-β de ser efectivamente inibida.
Os grânulos inflamatórios pélvicos são um medicamento eficaz para o tratamento de doenças inflamatórias pélvicas crónicas. Segundo a teoria da medicina chinesa, “as doenças de longa duração causam mais estase” e “as doenças de longa duração afectam os rins”, é utilizado para activar a circulação sanguínea e remover a estase sanguínea, tonificar os rins e cultivar a energia vital. Estudos anteriores mostraram que este medicamento pode melhorar a imunidade humoral e celular dos pacientes.
Os resultados desta experiência mostraram que os níveis de IL-1β, IL-8 e MCP-1 em ratos com doença inflamatória pélvica eram significativamente superiores aos do grupo normal, e os níveis de IL-10 eram significativamente inferiores aos do grupo normal, indicando que o equilíbrio entre factores pró-inflamatórios e anti-inflamatórios foi perturbado durante o processo patológico da doença inflamatória pélvica crónica. A dose de grânulos inflamatórios pélvicos reduziu os níveis de factores pró-inflamatórios e quimiocinas a vários graus, e aumentou os níveis de factores anti-inflamatórios IL-10 e aproximou os factores inflamatórios dos níveis normais, ou seja, restabelecendo o equilíbrio entre factores pró-inflamatórios e factores anti-inflamatórios, reduzindo assim a inflamação local e a fibroplasia.
Deduz-se que os Granulados Inflamatórios Pélvicos podem exercer os seus efeitos anti-inflamatórios e anti-adesivos restaurando o equilíbrio da rede de factores inflamatórios desequilibrados, que também podem fazer parte do mecanismo de acção da activação do sangue e do método tónico renal no tratamento desta doença.