As partículas em torno de próteses articulares artificiais podem causar recrutamento e fagocitose de macrófagos, que depois envolvem as partículas e libertam uma série de citocinas, formando granulomas inflamatórios e eventualmente levando à osteólise e ao afrouxamento. Uma variedade de partículas está presente em torno da prótese, incluindo partículas de UHMWPE, partículas de titânio e partículas de cimento ósseo. Observações histológicas clínicas demonstraram que a força da osteólise induzida por partículas de diferentes materiais varia, sendo as partículas de UHMWPE as que têm o efeito mais forte. O mecanismo exacto desta diferença na resposta biológica local devido a diferentes materiais de partículas é desconhecido e faltam estudos experimentais. A fagocitose de macrófagos das partículas é o passo inicial na resposta periprostética à osteólise, e quanto mais forte for a fagocitose, maior será a activação e mais forte a resposta inflamatória e osteólise. Nesta experiência, colocamos a hipótese de que diferentes partículas induzem diferentes fagocitoses de macrófagos e comparamos a diferença no grau de fagocitose de macrófagos induzida por dois tipos de partículas, UHMWPE e Ti-6AL-4V, para investigar as razões da diferença nas respostas biológicas induzidas por diferentes materiais de partículas a nível celular. Partículas e células 1. Partículas: As partículas de UHMWPE foram gentilmente dadas pelo Professor Wooley H. do Centro Médico John D. Dingle VA, EUA. As partículas têm uma morfologia irregular com um diâmetro médio de 2,6 μm (intervalo de diâmetro 0,8-23 μm,). As partículas de Ti-6AL-4V foram feitas no laboratório ortopédico do Nono Hospital Popular da Segunda Universidade Médica de Xangai, Patente No. 03142073.7. O processo foi o de encher um frasco de moinho do mesmo material com blocos de moinho feitos de Ti-6AL-4V, adicionar 70 mL de DMEM, colocado num agitador e agitado durante 21 dias, e as partículas dentro do DMEM foram extraídas por centrifugação por gradiente. As pastilhas de Ti-6AL-4V produzidas eram variáveis em morfologia com um diâmetro médio de 3,9 μm (intervalo de diâmetro 0,6-31 μm,). Para remover a endotoxina, os pellets foram suspensos em etanol a 75%, agitados e lavados quatro vezes à temperatura ambiente durante 1 hora de cada vez, e embebidos em etanol a 100% durante a noite. O conteúdo de endotoxinas foi determinado como sendo inferior a 0,25 EU/mL. O grânulo tratado foi suspenso e imerso em meio de cultura. 2. 264,7 células RAW: 264,7 células RAW (adquiridas ao Instituto de Investigação Celular, Academia Chinesa das Ciências, Shanghai) pertencem a uma linha de monócitos/macrófagos de rato com características duplas de macrófagos e células precursoras de osteoclastos, cultivadas em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/streptomicina a 37°C e 5% de CO2. As experiências foram divididas em 2 grupos de acordo com o pellet. Pellets de UHMWPE e pellets de Ti-6AL-4V foram adicionados ao meio de cultura e a concentração foi ajustada para 0,1 mg/mL para permitir o cultivo de células RAW 264,7 em condições estimuladas pelo pellet. Observação comparativa da fagocitose dos dois tipos de partículas por células RAW 264,7 1. Determinação da densidade óptima de resposta celular: Esta experiência utilizou o método MTT para encontrar a densidade óptima de resposta celular às partículas. Macrófagos (células RAW 264,7) foram co-cultivados com partículas UHMWPE e partículas Ti-6AL-4V a densidades de 1×103/mL, 1×104/mL, 1×105/mL e 1×106/mL, respectivamente, e foram efectuados ensaios de viabilidade celular MTT após 72h. Os resultados mostraram que as células RAW264,7 a uma densidade de 1×105/mL eram mais sensíveis à estimulação por partículas a uma concentração de 0,1 mg/mL. 2. observação da fagocitose de partículas: 264,7 células RAW a uma densidade de 1×105/mL foram co-cultivadas com 0,1mg/mL de partículas UHMWPE e partículas Ti-6AL-4V, respectivamente, e as células foram observadas ao microscópio de luz a partículas de fagocitose na 1ª, 4ª, 12ª, 48ª e 72h após a cultura. A proporção de células contendo grânulos fagocitosos em cada campo de visão em relação ao número total de células foi também contada sob um campo de visão 100x ao microscópio de luz na 1ª, 4ª, 48ª e 72h e repetida 3 vezes, enquanto se efectuava a análise estatística. Tratamento estatístico O software estatístico SPSS10.0 foi utilizado para realizar o teste do qui-quadrado, e a significância estatística foi considerada como р＜0.05. Resultados Macrófagos fagocitose de partículas de UHMWPE A resposta fagocitária dos macrófagos estimulados por partículas de UHMWPE foi rápida e forte. Às 48h, 96,4% das células continham partículas fagocitadas. 72h mais tarde, as células estavam saturadas com partículas e a proporção de células contendo partículas fagocitadas não aumentou. Ao mesmo tempo, observou-se que as células não proliferavam após a fagocitose, mas apresentavam fenómenos apoptóticos tais como aumento do corpo celular, forma de ovo frito e desprendimento de células. Quando o meio foi mudado para meio normal, as células que continham as partículas fagocitadas continuaram a morrer e a cair, enquanto as restantes células que não tinham partículas fagocitadas começaram a proliferar até que o prato inteiro foi coberto. Fagocitose de macrófagos de partículas de Ti-6AL-4V Em comparação com as partículas de UHMWPE, as partículas de Ti-6AL-4V causaram a fagocitose de macrófagos mais tarde e uma proporção relativamente menor de células fagocitou as partículas, um fenómeno que foi mais pronunciado no início da cultura. À 1h após a co-cultura de células RAW 264,7 com partículas de Ti-6AL-4V, havia pouca fagocitose celular das partículas. Às 4h após a incubação, houve uma pequena quantidade de fagocitose celular do grânulo. À medida que o tempo de incubação aumentava, o número de células a engolir o sedimento aumentou gradualmente, mas a proporção foi significativamente menor em comparação com o grupo de sedimento de UHMWPE no mesmo período de tempo. Em 72h, mais de 70% das células continham grânulos fagocitosos. As células que continham grânulos fagocitosos apresentavam menos alterações morfológicas e raramente apresentavam descamação de apoptose. Discussão O UHMWPE é a principal partícula causadora de osteólise Uma variedade de partículas de desgaste está presente em torno de próteses articulares artificiais, tais como partículas de UHMWPE, partículas de titânio, partículas de cimento ósseo, partículas de titânio puro e partículas de cobalto-cromo-molibdénio, que podem causar uma resposta biológica em torno da prótese e, através de uma série de alterações patológicas, eventualmente levar à osteólise e ao afrouxamento. Observações histológicas clínicas mostram que as partículas mais comuns e numerosas em torno da prótese são partículas de UHMWPE, que estão mais estreitamente relacionadas com a biologia peri-prótese do que outras partículas e são as partículas mais importantes que causam osteólise e afrouxamento: quando as partículas de UHMWPE dentro da membrana limite excederem 1 x 1010/g, a osteólise e o afrouxamento ocorrerão quase certamente e a vida útil da prótese será significativamente reduzida. As razões pelas quais as partículas de UHMWPE são mais susceptíveis de causar osteólise do que outras partículas ainda não foram completamente elucidadas. O principal mecanismo pelo qual as partículas causam osteólise e afrouxamento é através da estimulação de uma resposta biológica nas células circundantes da prótese, resultando num ambiente bioquímico local alterado e num desequilíbrio no metabolismo ósseo. Os macrófagos são as principais células de defesa-resposta no corpo e têm a relação mais directa e próxima com os grânulos. De acordo com observações histológicas, apenas um pequeno número de grânulos e macrófagos estava presente na membrana periprótese de uma prótese bem fixada, enquanto que a membrana parcialmente espessada de uma prótese solta continha um grande número de grânulos, e um grande número de macrófagos foram recrutados para fagocitose dos grânulos, e o número de macrófagos era proporcional ao número e volume de grânulos, sugerindo que os grânulos podem fazer com que os macrófagos sejam recrutados à volta da prótese e por eles fagocitados. Os resultados desta experiência também mostraram que os macrófagos começaram a fagocitose das partículas de UHMWPE após apenas 1 h de contacto com elas, e a fagocitose aumentou significativamente com o tempo, o que verificou que os macrófagos têm a capacidade de fagocitose das partículas. Após a fagocitose, os macrófagos são activados e sofrem uma série de reacções, causando alterações no ambiente bioquímico circundante, bem como alterações nos seus próprios traços. Em primeiro lugar, após a fagocitose, os macrófagos secretam uma variedade de mediadores bioquímicos e citocinas, incluindo TNF-α, IL-1, IL-6 e MMP, que causam granuloma inflamatório e reabsorção óssea em torno da prótese. Em segundo lugar, os macrófagos são as células precursoras dos osteoclastos, e sob estímulo de granulação, o número de osteoclastos diferenciados aumenta e a capacidade de reabsorção óssea aumenta, causando um desequilíbrio no metabolismo ósseo local e resultando em osteólise periprostética. As experiências demonstraram que as alterações biológicas acima referidas nos macrófagos só devem ocorrer após contacto ou engolfamento das partículas, e que se o contacto entre as partículas e as células for evitado, as alterações acima referidas não ocorrerão. Comparação da fagocitose entre partículas de UHMWPE e partículas de titânio Este estudo experimental mostrou que em comparação com partículas de Ti-6AL-4V, as partículas de UHMWPE foram capazes de induzir uma fagocitose rápida e forte dos macrófagos. as partículas de uHMWPE foram fagocitadas imediatamente após o contacto com os macrófagos, e a fagocitose tornou-se cada vez mais óbvia com o tempo, e a proporção de células contendo partículas aumentou rapidamente, e por 72 h, tiveram A fagocitose foi saturada por 72h. Em contraste, no grupo de partículas Ti-6AL-4V, o fenómeno da fagocitose apareceu mais tarde e a proporção de células contendo partículas fagocitadas foi significativamente inferior à do grupo de partículas UHMWPE durante o mesmo período de tempo. Estudos anteriores sugeriram que a principal razão pela qual as partículas de UHMWPE são um factor importante no desenvolvimento da osteólise é que são numerosas e muito mais numerosas do que a soma das outras partículas, e portanto causam uma resposta biológica mais forte. Os resultados desta experiência mostram que mesmo com a mesma densidade de partículas, as partículas de UHMWPE estimulam a fagocitose por macrófagos mais forte e rapidamente do que as partículas de titânio. Como os macrófagos precisam de fagocitosear as partículas antes de poderem reagir biologicamente, pode especular-se que as próprias partículas de UHMWPE também induzem uma fagocitose mais forte e uma resposta biológica dos macrófagos do que outras partículas, produzindo mais mediadores inflamatórios e citoquinas, o que explica porque as partículas de UHMWPE são mais susceptíveis de induzir a osteólise do que outras partículas de outra perspectiva. Em conclusão, as partículas de UHMWPE induzem uma fagocitose de macrófagos mais rápida e mais intensa do que as partículas de Ti-6AL-4V, o que leva a uma série de reacções bioquímicas que acabam por resultar numa resposta periprostética mais forte da osteólise e num afrouxamento.