O linfoma é um tumor maligno que ocorre no tecido linfóide. O tecido linfóide é constituído por linfócitos T e B, histiócitos e outras células imunologicamente activas. Devido à sua estrutura histológica especial, pode produzir vários graus de hiperplasia reactiva quando estimulada por antigénios, ruptura da estrutura normal dos gânglios linfáticos, proliferação de imunoblastos, aumento da fase de fissão nuclear e outras aparências pseudo-malignas. Portanto, é por vezes difícil determinar a sua natureza benigna ou maligna com base apenas em observações morfológicas. Actualmente, cerca de 70% das doenças linfóides proliferativas em patologia geral podem ser diagnosticadas definitivamente com base em secções de rotina em cerca de 25% dos casos. No entanto, nada pode ser feito para células imaturas precoces sem marcadores de superfície, ou para células anormais que tenham perdido os seus marcadores de superfície. Em casos com um componente celular altamente reactivo proliferativo, as células tumorais podem ser mascaradas, mesmo que tenham um imunofenótipo. Inversamente, os falsos positivos podem também resultar da propagação de antigénios devido à manipulação, por exemplo. Os ensaios de rearranjo genético clonal desenvolvidos nos últimos anos oferecem a possibilidade de confirmar o diagnóstico em amostras difíceis, precoces ou microscópicas e são um importante complemento ao exame morfológico e aos métodos imunohistoquímicos. Uma classe de glicoproteínas que consiste em múltiplas subunidades que têm a capacidade de se ligar especificamente a anticorpos ou antigénios na superfície dos linfócitos, incluindo IgH e IgL produzidos por linfócitos B e TCR (receptor de células T) produzidos por células T. Ambos têm codificação genética semelhante e são geralmente compostos por regiões variáveis (região V), variáveis (região D), juncionais (região J) e constantes (região C). No estado germinal, a divisão destas regiões no cromossoma é descontínua. Os genes V, D, J e C estão dispostos num padrão linear desde a extremidade de 5′ até à extremidade de 3′ numa única fita de ADN, com sequências de inserção de comprimentos variáveis ainda a separá-los. Quando os linfócitos atingem uma determinada fase de desenvolvimento, são selectivamente unidos pela acção de recombinases especiais (isto é, rearranjo do gene) de modo a formar um gene funcionalmente expresso. Os linfócitos são submetidos a vários rearranjos genéticos desde a diferenciação das células-mãe até à maturidade. Como existem múltiplos fragmentos de genes seleccionáveis em cada uma das regiões V, D e J, a liberdade de rearranjo dos genes pode atingir os 106 a 107. Numa base individual, cada linfócito tem uma forma específica de rearranjo genético, ou seja, uma estrutura única de codificação genética, para cada antigénio ou gene receptor codificado. Se um linfócito T ou B desenvolver uma proliferação monoclonal nalguma fase do rearranjo, torna-se um linfoma. Isto significa que a proliferação clonal de células linfomáticas resulta numa predominância quantitativa da forma particular de rearranjo genético. Isto torna-se um indicador da clonalidade das células. Esta é a base teórica do diagnóstico genético do linfoma. Actualmente, existem dois métodos principais utilizados para a análise de rearranjos genéticos no linfoma. Este método foi concebido pela primeira vez por Mullis et al. nos EUA (1985). Em 1989 foi reportado que era utilizado para erupções genéticas de linfoma. O princípio é seleccionar cerca de 20 sequências de nucleótidos conservados nas regiões V, D, J e C dos códigos dos genes IgH e TCR, sintetizar artificialmente um ou mais pares de iniciadores (genes da família), complementar as bases isoladas do ADN modelo a ser testado e amplificar o fragmento de sequência de ADN alvo. No caso de linfoma o produto de amplificação aparece como uma banda monoclonal única por electroforese. Em contraste, o tecido linfóide proliferativo benigno aparece como um esfregaço difuso e não forma uma única banda. A literatura relata que o diagnóstico genético de linfoma por PCR é específico, sensível, rápido e pode ser utilizado em tecidos frescos e com inclusão de parafina. No entanto, o único gene que foi detectado com sucesso pela PCR é o gene IgH. O método PCR para rearranjo do gene IgH tem também dois problemas óbvios: 1) muitos factores influenciadores e estabilidade deficiente; 2) mais de 10% de falsos negativos e sensibilidade precisam de ser melhorados. II. hibridização da mancha sul Este método foi relatado pela primeira vez pela Southern, University of Edinburgh, Escócia (1975). O princípio é que duas bases de ADN de cadeia única podem ser combinadas com uma sonda de ADN sintética complementar de cadeia única (normalmente rotulada com um isótopo.) A aplicação do método Southern Blot à detecção de rearranjo genético foi realizada pela primeira vez por Korsmeyer et al. em 1981. O ADN celular é extraído e clivado enzimaticamente com endonucleases de restrição, e são produzidos fragmentos característicos de ADN da linha germinal. No entanto, o ADN celular que sofreu rearranjo genético alterou os sítios enzimáticos, produzindo fragmentos enzimáticos de ADN que diferem da linha germinal. Após transferência da membrana, a hibridação com uma sonda de DNA rotulada revelará bandas de rearranjo clonal se um certo número de linfócitos proliferadores clonados estiver presente (>1-5%). Para a proliferação linfocítica normal ou policlonal, as bandas difusas são mostradas devido ao tamanho variável dos fragmentos rearranjados. A análise sul foi aplicada à detecção de rearranjos clonais em IgH, Igk, Ig1 e vários TCR e é considerada o “padrão de ouro” para a detecção de rearranjos genéticos com sensibilidade e fiabilidade satisfatórias. No entanto, devido à necessidade de grandes quantidades (10mg) de tecido fresco ou congelado, à complexidade do procedimento, ao tempo que leva (cerca de duas semanas), à necessidade de rotulagem de isótopos com excesso de emissões e à facilidade de contaminação, é apenas adequado para a investigação e não para o diagnóstico clínico. Os kits de quimioluminescência da DAKO marcados com fluoresceína IgH, Igk, Ig1 e vários kits de quimioluminescência com sonda TCR superam estas desvantagens, substituindo isótopos por fluoresceína como marcador; reduzindo o tempo de exposição (5-10 minutos) sem reduzir a sensibilidade, o que é muito benéfico para a promoção e aplicação no diagnóstico clínico.