Durante mais de 10 anos, foram desenvolvidos globalmente métodos de diagnóstico da tuberculose, e alguns novos métodos foram aprovados para utilização nos Estados Unidos, Europa, e outros países desenvolvidos. Para um país com uma elevada carga de tuberculose como a China, a detecção de doentes basicamente através de métodos convencionais de testes bacteriológicos pode fazer falta a muitos doentes com tuberculose activa, causando a propagação da tuberculose e agravando o perigo para a sociedade. Irei concentrar-me na necessidade da sociedade de novos métodos de diagnóstico da tuberculose, na situação dos testes usados rotineiramente e em vários testes promissores, e explorar métodos de diagnóstico promissores que possam ser usados.
I. A necessidade de novos métodos de diagnóstico para a tuberculose
Na ausência de uma vacina contra a tuberculose verdadeiramente eficaz, o tratamento da tuberculose bacilar-positiva continua a ser o componente mais importante dos programas de controlo da tuberculose. O diagnóstico rápido e preciso é uma necessidade, e tanto nos países desenvolvidos como nos atrasados, os métodos de diagnóstico rápido e mais preciso da tuberculose do que os métodos convencionais são uma tendência inevitável para o controlo da tuberculose activa.
Em muitos locais, o valor do esfregaço de saliva para encontrar o complexo de Mycobacterium avium que cresce no exame da saliva dos doentes diminuiu gradualmente, e o diagnóstico de tuberculose é apenas um diagnóstico possível, combinado com a presença de tosse e imagens anormais do raio-X torácico em pessoas mais velhas, ou se o doente estiver infectado pelo VIH, o diagnóstico de tuberculose é estabelecido. Isto levou a um declínio na especificidade das manchas de saliva no diagnóstico da tuberculose, chegando mesmo a baixar para 50% em alguns casos. Na experiência clínica, um teste com 50% de sensibilidade e 95% de especificidade tem um valor muito maior do que um teste com a mesma sensibilidade, mas apenas 50% de especificidade. No primeiro teste a fiabilidade de um diagnóstico ambulatório de 10% foi de 53%, e inversamente no segundo teste a fiabilidade foi de apenas 10%, e o valor de excluir o diagnóstico foi de 94% e 50%, respectivamente.
Por outro lado, um teste que pode distinguir rapidamente entre Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium avium complex, por exemplo, com um tal dispositivo pode evitar o contacto desnecessário com pacientes no início do departamento de saúde para detectar pacientes bacteriologicamente positivos e pode atribuir recursos limitados para utilização onde são mais necessários. Nos Estados Unidos e noutros países, a utilização generalizada de testes de amplificação do ácido nucleico evoluiu até certo ponto, embora estes testes ainda não tenham sido validados e os dispositivos ainda não tenham sido finalmente adoptados.
A falta de testes diagnósticos rápidos e precisos para a tuberculose resultou em despesas significativas no isolamento de pacientes e em tratamentos empíricos desnecessários. Além disso, tal tratamento pode aumentar os custos, causando efeitos secundários dos medicamentos.
Nos países pobres, o foco está no diagnóstico e tratamento de pacientes com tuberculose bacilar-positiva, principalmente devido a isso.
Em primeiro lugar, devido ao custo elevado, a cultura de micobactérias não está amplamente disponível em muitas partes do mundo e o diagnóstico baseia-se principalmente na apresentação clínica, raio-X e esfregaço de expectoração. Em segundo lugar, a positividade da expectoração indica uma elevada probabilidade de infecciosidade e há uma significância significativa no tratamento desses pacientes para reduzir a fonte de infecção. Devido a estas condições, esta é obviamente a única via a seguir, mas os doentes com expectoração negativa também precisam de ser tratados porque, em primeiro lugar, especialmente em países pobres, um grande número de doentes com tuberculose são casos de bacilos negativos, e pelas razões acima mencionadas estes doentes vão sem dúvida ser mal diagnosticados, levando a uma grave progressão da doença (que pode causar danos permanentes, tais como perda da função pulmonar).
Em segundo lugar, embora os indivíduos com expectoração positiva sejam responsáveis pela maior parte da transmissão da TB na população, análises recentes utilizando estudos de polimorfismo de restrição do comprimento da secção de endonuclease (RFLP) demonstraram que os doentes com TB com expectoração negativa também são infecciosos, não tão não infecciosos como se pensava anteriormente, e que a infecciosidade aumenta com o número de casos de bacilus-negativos. Assim, o diagnóstico preciso por indivíduos com expectoração positiva é uma despesa valiosa, tanto para indivíduos como para grupos com tuberculose.
Tanto em países com poucos recursos como em países ricos, as características clínicas (principalmente os sintomas dos doentes e a apresentação dos raios-X) podem aumentar a taxa de diagnóstico da tuberculose em 50% ou mais, e estas podem ajudar a visar doentes suspeitos e a realizar testes diagnósticos de rotina, mas é evidente que as características clínicas por si só não podem fornecer uma base fiável para o diagnóstico da tuberculose.
Em segundo lugar, novos testes de diagnóstico da tuberculose
1. Testes de diagnóstico da tuberculose activa
Sistemas de cultura rápida para Mycobacterium bifidum: Notavelmente, por exemplo, BACTEC, MGIT, MB/BacT, Septi-check e ESP, ao combinar estas séries líquidas de meios com sondas de ADN para identificação rápida de micobactérias, a maioria das amostras de esfregaço de expectoração positiva pode ter resultados positivos em 2 semanas ou menos, e as amostras de esfregaço negativo só demoram menos de 3 semanas. Uma vez que este método é o único que é amplamente utilizado e pode ser utilizado para testes de sensibilidade às drogas, o seu valor é insubstituível.
Testes de amplificação de ácidos nucleicos: Existem 2 técnicas de amplificação de ácidos nucleicos amplamente utilizadas nos Estados Unidos, MTD (Genprobe) e AmPlicor (Roche), e o MTD é principalmente utilizado em casos de tuberculose com expectoração negativa mas altamente suspeitos clinicamente. Fornece um ambiente de temperatura constante para a amplificação do ácido nucleico, enquanto o dispositivo AmPlicor aplica a tecnologia PCR para multiplicar ácidos nucleicos alvo únicos que podem ser usados para identificar Mycobacterium tuberculosis em amostras clínicas. Embora os ácidos nucleicos alvo que são multiplicados variem, os artigos publicados sugerem que o papel clínico desta série de experiências é essencialmente o mesmo. Quase sempre fornecem um diagnóstico correcto em casos de difamação da saliva, e têm uma taxa de confirmação de 50% em casos de difamação da saliva negativa, mas casos de cultura positiva. Com base nas suas vantagens, a FDA dos EUA utiliza-o desde o início para identificar a expectoração positiva em casos clinicamente suspeitos.
Com base no diagnóstico rápido da tuberculose com o teste NAA, a American Thoracic Society perguntou recentemente: Qual é a melhor utilização do NAA? Os sucessivos artigos publicados sobre os testes NAA têm afirmado que podem detectar a tuberculose quase completamente com referência aos casos que são fiavelmente positivos à saliva. Ao mesmo tempo, os artigos também afirmam: esta técnica deve ser promovida, e pode ser mais precisa do que os métodos actuais de diagnóstico da tuberculose.
Numa experiência recente, a NAA foi comparada com o esfregaço e a cultura convencionais da expectoração, e a sua especificidade era bastante elevada, mas a sua sensibilidade não era exactamente a mesma, 50% para o esfregaço e 100% para a cultura, embora a sensibilidade da NAA estivesse ao nível de 80-84%, foi demonstrado repetidamente que podia detectar todos os casos baciloscópicos positivos e diagnosticar metade dos casos baciloscópicos negativos, mas casos de cultura positivos. Portanto, combinando todos os casos (verdadeiros resultados positivos e negativos), a NAA é muito mais sensível do que o esfregaço e apenas ligeiramente menos sensível do que a cultura. Algumas novas experiências relatam que a NAA é também única no diagnóstico da tuberculose esfregaço-negativa. Por outras palavras, se alguém perguntar: “Posso detectar tuberculose activa no meu doente com NAA?
A resposta actual é provavelmente 92-95% exacta, enquanto a baciloscopia é apenas 80% exacta (com a advertência de que o paciente é primário, e se o paciente for tratado de novo, a NAA será menos exacta). De facto, se o custo do teste for mais baixo, o NAA pode ser usado em vez do escarro para diagnosticar os doentes com tuberculose primária. Evidentemente, a sua especificidade deve ser igual ou superior à do método de baciloscopia antiácida (AFB) agora aplicado em muitas áreas. Actualmente, devido ao seu elevado custo ($50-$100 por teste), a AFB é relativamente económica apenas em grandes laboratórios centrais, onde um grande número de amostras pode ser testado rápida e facilmente ao mesmo tempo. Há também relatórios que sugerem que a NAA poderia ser utilizada em países pobres quando o seu preço é ajustado a um determinado nível.
Os Centros de Controlo e Prevenção de Doenças dos EUA (CDC) recomendam NAA para o diagnóstico de tuberculose activa e recomendam que se realize uma esfregaço de AFB e NAA na primeira colheita de expectoração.
①If ambos são positivos, o diagnóstico de tuberculose é basicamente confirmado.
②If o esfregaço de AFB é positivo e o NAA é negativo, recomendam a utilização de um inibidor para suprimir a possível decomposição de Mycobacterium tuberculosis na amostra e depois repetir o teste.
③If o esfregaço de AFB é negativo para NAA, o CDC recomenda o envio da amostra mais frequentemente, e se o esfregaço de AFB for considerado positivo, o diagnóstico do doente é confirmado.
④When tanto o esfregaço de AFB como o NAA são negativos, deve ser feito um NAA adicional, e se ainda for negativo, o diagnóstico de TB pode ser excluído. Sugere-se também que os trabalhadores clínicos não devem ignorar a base clínica relevante, porque o diagnóstico final ainda depende da eficácia e dos resultados da cultura.
Segue-se que a utilização racional de NAA para o diagnóstico rápido da tuberculose deve ser orientada pelos seguintes princípios: A NAA pode ser utilizada para confirmar ainda mais o diagnóstico naqueles com um esfregaço positivo de AFB. Se o esfregaço de AFB for negativo e o diagnóstico clínico for altamente suspeito, uma amostra de escarro deve ser colhida estritamente para testes de NAA, que devem ser ou escarro profundamente tossido ou escarro estimulado pela indução da tosse. Embora um diagnóstico rápido não possa ser feito com este método em mais de 50% dos casos com esfregaços negativos de AFB mas culturas positivas, é evidente uma taxa bastante elevada de diagnóstico rápido nos casos com esfregaços negativos de AFB. A viabilidade deste método foi confirmada pela FDA no ensaio MTD-2, e a NAA não pode ser utilizada nos casos em que o esfregaço de AFB é negativo e o diagnóstico de tuberculose não é clinicamente adequado.
No passado, o papel do exame do esfregaço de saliva era principalmente determinar se o doente era infeccioso e analisar a eficácia, mas não há informação sobre se a NAA tem esta capacidade. Embora tenha sido afirmado que um NAA negativo em vários espécimes diferentes pode excluir em grande parte a tuberculose, ainda não há provas de quantas vezes um NAA negativo deve ser feito para excluir completamente o diagnóstico de tuberculose. Além disso, o valor diagnóstico do NAA para a tuberculose é inconclusivo.
Por exemplo, se a amostra de líquido cefalorraquidiano (LCR) for positiva para NAA, pode presumir-se que o paciente tem meningite tuberculosa, mas para os casos que satisfazem basicamente os critérios de diagnóstico clínico, mesmo uma NAA negativa não pode excluir o diagnóstico, por isso, actualmente, a série de experiências de NAA ainda não pode substituir o estado da cultura da amostra.
2, determinação rápida da resistência aos fármacos
Em muitas partes do mundo, a tuberculose multirresistente tornou-se um problema sério, pelo que as experiências rápidas de suscetibilidade aos medicamentos têm grande significado para o tratamento e controlo da tuberculose. Na maioria dos casos, encontrar resistência à rifampicina é suficiente para indicar a necessidade de mudar para um medicamento de segunda linha contra a tuberculose. Isto é feito testando a população real para a resistência aos medicamentos (observando o estado de sobrevivência do organismo no ambiente da rifampicina). Um desses métodos, chamado “análise nemática”, que determina organismos resistentes detectando alterações no gene rpoB associado à resistência às drogas, gerou lucros comerciais consideráveis na Europa.
Este método é particularmente popular em locais como a Rússia, onde existe um elevado número de doentes multi-resistentes à tuberculose, e em locais onde a resistência primária aos medicamentos é um problema grave. Contudo, não tem sido utilizado clinicamente até agora devido ao seu elevado custo (pelo menos o equivalente a um teste de NAA por teste).
Análise do relatório do gene da luciferase: Nesta experiência, um espécime (por exemplo, expectoração) é colocado no meio de cultura e misturado com fago de Mycobacterium tuberculosis contendo luciferase após o meio-dia, e se houver Mycobacterium tuberculosis sobrevivente na expectoração, será engolido no fago, altura em que o gene da luciferase começa a funcionar e se torna luciferase livre, emitindo luz visível. Depois, estes espécimes contendo Mycobacterium tuberculosis são colocados num meio contendo drogas anti-TB e estão prontos para testes de sensibilidade às drogas.
Embora o teste tenha sido inicialmente impressionante, o seu progresso clínico tem sido lento. Os investigadores têm lutado para encontrar um método tecnicamente simples e económico que possa ser utilizado em países economicamente desfavorecidos. A versão actual deste teste é a BronxBox, que utiliza película de placa fluorescente artificial para exibir e registar os resultados do teste, e é capaz de detectar a Mycobacterium tuberculosis viva no prazo de 2 dias.
Sinalização molecular: Foi publicado um método para detectar Mycobacterium tuberculosis usando tecnologia de sinalização molecular com moléculas que brilham durante reacções químicas específicas que ocorrem quando os iniciadores com ADN único são enrolados de volta aos seus fragmentos alvo numa reacção PCR. Desta forma, o diagnóstico preciso e rápido pode ser feito com elevada precisão e especificidade, e pode ser utilizado não só para o diagnóstico da tuberculose, mas também para a determinação rápida da resistência aos antibióticos, mas o sinal molecular requer equipamento dispendioso, pelo que não está amplamente disponível. No entanto, no futuro, a PCR para detecção dessas doenças infecciosas está a ser desenvolvida e melhorada por laboratórios clínicos, e os sinais moleculares serão cada vez mais amplamente utilizados.
3.Detection de tuberculose latente
As recentes directrizes de investigação para a detecção de infecção por TB latente concentraram-se na selecção de alvos de teste, sendo apenas considerados os doentes que provavelmente serão positivos, e outro método para a determinação mais precisa da infecção latente (sem reactividade cruzada com BCG ou NTM) ajudará muito a este objectivo estratégico.
Estudos da produção de interferão por células mononucleares do sangue periférico: Como resposta à estimulação por M. tuberculosis, estes linfócitos CD4+ e CD8+ T produzem interferão gama, o que tem efeitos anti-inflamatórios. Recentemente, foram feitas tentativas de usar estas respostas imunitárias para diagnosticar a infecção pelo M. tuberculosis. As células mononucleares isoladas do sangue periférico de doentes com tuberculose estabelecida são usadas para sintetizar a PPD, e o interferão γ estimulado por estas células pode ser simplesmente detectado por ELISA. Alguns estudos relataram que este método pode detectar com precisão a infecção por tuberculose latente sem necessidade de acompanhamento do doente para pedir resultados de testes em comparação com o teste cutâneo tradicional, mas é tecnicamente mais complexo e dispendioso.
O diagnóstico da infecção por TB latente tem sido limitado pela falta de um padrão de ouro. Inicialmente, o teste utilizando o interferão γ produzido pela estimulação da tuberculina foi realizado em pessoas susceptíveis de terem infecção por TB latente, e a sensibilidade deste método foi de 90% e a especificidade foi de 98% quando analisado com resultados de testes cutâneos. Foi também demonstrado que este método pode distinguir entre aqueles que estão verdadeiramente infectados e aqueles que estão vacinados com BCG, e também demonstrou alguma capacidade de distinguir entre a Mycobacterium tuberculosis e as infecções micobacterianas não tuberculosas.
A especificidade do IFN também pode ser aumentada estimulando as células com “6-antigénio precoce (ESAT-6)”, que é um produto de micobactérias, incluindo BCG, e pode ser utilizado para diferenciar entre Mycobacterium tuberculosis e outras micobactérias.
Contudo, a viabilidade e operabilidade do IFN para o diagnóstico da tuberculose latente ainda é uma questão, uma vez que precisa de ser comparado com TST e TFN em áreas com elevada incidência de tuberculose para ver qual o teste mais preciso na previsão da progressão da doença activa.
III. Conclusão
Embora muitas técnicas novas para o diagnóstico da tuberculose tenham sido desenvolvidas e sejam superiores ao método de esfregaço AFB em termos de sensibilidade, especificidade, e precisão estatística, apenas um ensaio de amplificação do ácido nucleico (NAA) ganhou realmente tracção. Embora estas novas técnicas representem uma enorme melhoria na exactidão em relação ao método de esfregaço de AFB e sejam mais eficientes em termos de tempo do que a cultura de micobactérias, os maiores investimentos e requisitos de equipamento limitam grandemente a aplicação clínica, e os testes rápidos de sensibilidade aos medicamentos são também viáveis para uso clínico em laboratório. No entanto, deve notar-se novamente que nenhuma destas novas técnicas pode ainda avaliar com precisão a infecção de um doente e detectar os efeitos do tratamento, tal como os dois métodos de esfregaço de AFB actualmente em uso.
O desenvolvimento de novas técnicas de teste para a tuberculose enfrenta enormes desafios e é difícil de escalar mesmo em países relativamente ricos, quanto mais pobres, devido aos elevados custos. Portanto, no futuro, as novas técnicas de diagnóstico da infecção latente e da tuberculose activa devem ser não só clinicamente úteis mas também rentáveis.