A ventilação de um pulmão (OLV) é um modo especial de ventilação mecânica para cirurgia torácica; contudo, produz inevitavelmente alguns efeitos adversos ao mesmo tempo que permite que ambos os pulmões sejam ventilados separadamente e proporciona condições convenientes para a cirurgia. No trabalho de anestesia clínica, a lesão pulmonar induzida por OLV tem recebido uma atenção crescente, mas a patogénese da lesão pulmonar induzida por OLV não tem sido elucidada. Nos últimos anos, a apoptose desempenha um papel importante na lesão do tecido pulmonar, e alguns estudos têm sugerido a ocorrência de apoptose epitelial alveolar na fase inicial da ventilação mecânica [1], enquanto que estudos sobre apoptose no tecido pulmonar durante a OLV raramente têm sido relatados. O objectivo desta experiência foi estudar a expressão do índice apoptótico e do factor de execução da apoptose Caspase-3 no tecido pulmonar durante a OLV e analisar a relação entre as suas alterações e a lesão pulmonar causada pela OLV. Huang Bing, Departamento de Anestesiologia, Hospital do Cancro, Universidade Médica de Guangxi
Materiais e métodos
Grupos de animais 42 ratos machos saudáveis SD, pesando 200-250 g (fornecidos pelo Centro Experimental Animal da Universidade Médica de Guangxi). Os ratos foram divididos em grupo de controlo em branco (grupo C), grupo de controlo de ventilação de duplo pulmão (grupo B), e grupo de ventilação de simples pulmão (grupo A). grupo C foi o grupo de respiração espontânea, e os grupos A e B foram divididos em três subgrupos: grupo A1 (OLV 0. 5h, retomada da ventilação 0,5h), grupo A2 (OLV 1h, retomada da ventilação 0,5h), grupo A3 (OLV 1,5h, retomada da ventilação 0,5h) e grupo B1 (ventilação de duplo pulmão 1h), grupo B2 (1,5h de ventilação de duplo pulmão), e grupo B3 (2h de ventilação de duplo pulmão). Os ratos foram atribuídos aleatoriamente, seis ratos em cada grupo, sete grupos no total.
Preparação do modelo Os ratos do grupo A foram anestesiados com cetamina 80mg/kg, e Simeon II 0,6~0,8ml/kg intramuscularmente, realizou-se uma traqueotomia e inseriu-se um tubo traqueal caseiro na traqueia principal, deu-se brometo de vecurónio 2mg/kg, e quando a respiração desmaiou, ligou-se um ventilador (ventilador animal miniatura tipo I de Jiangwan) para ventilação mecânica. Volume corrente (VT): 10 ml/kg, frequência respiratória (RR): 60 vezes/min. O tórax foi aberto no quinto espaço intercostal do lado esquerdo, o pulmão esquerdo foi exposto, o tubo traqueal foi inserido demasiado profundamente no brônquio direito, os parâmetros de ventilação foram ajustados VT: 5-6 ml/kg, RR: 80 vezes/min. No grupo B, após a exposição do pulmão esquerdo, ambos os pulmões foram mantidos ventilados até à hora marcada.
Os espécimes foram recolhidos de ratos do grupo C após anestesia e foram rapidamente descarregados da artéria carótida, enquanto que nos grupos A e B, os animais foram descarregados da artéria carótida imediatamente após a ventilação para um tempo pré-determinado. Os tecidos restantes do lobo inferior do pulmão esquerdo foram colhidos e armazenados a -80℃ num frigorífico de temperatura ultra baixa para exame.
Itens e métodos de detecção As alterações morfológicas e estruturais dos tecidos pulmonares foram observadas sob microscopia de luz HE; a expressão da proteína Caspase-3 nos tecidos pulmonares foi detectada por immunoblotting, e as imagens das bandas proteicas da reacção Western blot após o scan da película foram analisadas pelo sistema de análise de imagens em gel do Image Lab, e os valores de escala de cinzentos das bandas alvo foram calculados para cada grupo de bandas proteicas alvo e a referência interna Foi calculada a razão entre o valor de escala de cinzentos de cada banda proteica alvo e o valor de escala de cinzentos da banda proteica GAPDH de referência interna; o índice apoptótico do tecido pulmonar foi detectado através da coloração in situ do rótulo final (TUNEL) (10 campos não duplicados foram seleccionados para cada secção, e as células positivas foram coloridas com núcleos amarelo-acastanhados.
Análise estatística A análise estatística foi realizada pelo pacote de software SPSS13.0, e os dados de medição foram expressos como média ± desvio padrão (x(_)±s). Foi utilizada ANOVA unidireccional para comparação entre subgrupos, e o teste LSD-t foi utilizado para comparação bidireccional entre grupos. O teste t foi utilizado para comparar amostras entre subgrupos correspondentes; P < 0,05 foi considerado uma diferença estatisticamente significativa.
Resultados
O espessamento do interstício era óbvio.
Coloração TUNEL Não foram vistas células apoptóticas no tecido pulmonar do grupo C; um pequeno número de células apoptóticas foi visto no tecido pulmonar do grupo B a 2 h de ventilação em ambos os pulmões. O índice apoptótico foi significativamente mais elevado no grupo A3 em comparação com o grupo B3 (P < 0,05).
Conteúdo proteico da Caspase-3 no tecido pulmonar Em comparação com o grupo C, não houve alteração significativa no conteúdo proteico da Caspase-3 no grupo A1 (P > 0,05), e a expressão aumentou nos grupos A2 e A3 (P < 0,05), e com a extensão do tempo de ventilação, grupo C = grupo A1 < grupo A2 < grupo A3 (P < 0. 05); em comparação com os subgrupos do grupo B, a diferença entre os grupos A1 e B1 não foi estatisticamente significativa (P＞0.05), e a expressão nos grupos A2 e A3 aumentou em comparação com os grupos correspondentes B2 e B3 (P＜0.05).
Tabela 1 Comparação do índice de apoptose e expressão da proteína Caspase-3 no tecido pulmonar de ratos entre os grupos (n=6,`x±s)
Índice de detecção
Grupo C
Grupo A1
Grupo A2
Grupo A3
Grupo B1
Grupo B2
Grupo B3
AI(%)
0.12±0.08
0.13±0.08
6.17±0.75 ab
16.00±1.10 ab
0.15±0.10
0.18±0.08
4.83±0.75 a
Caspase-3
0.21±0.02
0.22±0.02
0.34±0.01ab
0,69±0,01ab
0.22±0.01
0.23±0.01
0.28±0.01a
aP<0,05 em comparação com o grupo C; bP
DISCUSSÃO
OLV como ventilação mecânica especial é agora amplamente utilizada em cirurgia torácica, mas a adulteração do sangue venoso durante OLV devido à insuficiente oxigenação do sangue no lado não ventilado do pulmão causa hipoxia do tecido pulmonar e leva a lesão das células do tecido pulmonar, bem como a uma deficiência funcional, para além disso, Os resultados experimentais mostraram que com o prolongamento do OLV, os tecidos pulmonares dos ratos mostraram gradualmente a destruição da estrutura alveolar, congestão e edema, e o espessamento gradual do espaço intersticial, o que é consistente com os resultados do estudo anterior [3].
A lesão pulmonar induzida por OLV envolve uma variedade de mecanismos complexos de lesão, incluindo lesões mecânicas e biológicas. Muitos estudos dos últimos anos sugeriram que vários factores estão envolvidos no processo de lesão pulmonar aguda ao induzir uma apoptose excessiva das células do tecido pulmonar, levando à destruição estrutural dos alvéolos e agravando os danos nas membranas capilares alveolares [4]. Em estudos de ventilação mecânica, acredita-se principalmente que as células epiteliais brônquicas e as células epiteliais alveolares promovem a apoptose activando a resposta inflamatória em cascata da NF-κB devido à estimulação da tracção mecânica [1]. Nesta experiência, foi observado um pequeno número de células apoptóticas no tecido pulmonar do grupo de controlo a 2 h de ventilação; enquanto no grupo OLV, com o prolongamento do tempo OLV, foi observado um pequeno número de células apoptóticas nos flancos internos da luz alveolar de ratos a 0. 5 h de retenção de OLV 1h, e foram encontradas mais células apoptóticas nos flancos internos do lúmen alveolar e no interstício de ratos a 0,5 h de retenção após 1,5 h de OLV, e estas alterações foram mais acentuadas do que as do mesmo tempo Estas alterações foram mais pronunciadas no tecido pulmonar de ratos no grupo de ventilação de dois pulmões do que no mesmo tempo. Krick e colegas [5] descobriram que a indução de factor induzível de hipoxia (HIF-1) induziu apoptose em células epiteliais alveolares tipo II em ratos expostos a hipoxia. Durante o OLV, o lado não ventilado das atrofias pulmonares e a pressão parcial do oxigénio alveolar diminui, tornando o tecido pulmonar de teste não ventilado hipóxico, o que pode levar à apoptose das células do tecido pulmonar. Esta diminuição da pressão parcial do oxigénio alveolar pode causar um aumento da resistência vascular pulmonar (HPV), que é uma resposta compensatória da circulação pulmonar à hipoxia, mas enquanto o HPV desempenha estes papéis protectores, também diminui a quantidade de perfusão sanguínea nos tecidos pulmonares. No grupo OLV, os ratos retomaram a ventilação durante 0,5 h após OLV durante um período de tempo pré-determinado, e quando a ventilação foi restaurada, a rápida restauração do fornecimento de oxigénio ao tecido pulmonar poderia também activar PMN no tecido pulmonar e activar o stress oxidativo, o que poderia causar radicais livres de oxigénio, factor de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-lβ (LI-lβ) no sangue e tecido pulmonar. lβ (LI-lβ) e outros mediadores inflamatórios são aumentados [6]. Os resultados de um estudo de You et al [7] também mostraram que o nível de stress oxidativo no tecido pulmonar aumentou significativamente durante o OLV em coelhos, e esta tendência foi mais pronunciada com o prolongamento do tempo de OLV. Contudo, grandes quantidades de factores inflamatórios como os radicais livres de oxigénio, TNF-α e LI-lβ podem levar a um aumento da apoptose das células epiteliais alveolares e das células endoteliais vasculares e resultar em disfunção do ecrã endotelial vascular pulmonar [8].An S et al [9] sugeriram que a isquemia-reperfusão do intestino delgado leva à apoptose das células epiteliais do tipo II através da upregulação de TNF-α, causando assim lesão do tecido pulmonar. No processo de reabertura após atrofia pulmonar no lado não ventilado, a expansão alveolar nem sempre é coordenada, e o estiramento excessivo da parede alveolar por forças tangenciais interfaciais geradas na junção de alvéolos expandidos e atrofiados pode causar apoptose de células epiteliais alveolares [10]. O aumento de células apoptóticas no tecido pulmonar com o prolongamento do tempo OLV na presente experiência pode levar a danos estruturais alveolares e agravamento das alterações histopatológicas pulmonares, o que é consistente com as alterações histopatológicas pulmonares observadas sob microscopia da luz na presente experiência.
A Caspase-3 é o efeito apoptótico mais importante da família Caspase, responsável pela clivagem de todas ou algumas das proteases chave durante a fase de execução da apoptose, levando à fragmentação do ADN e à morte das células apoptóticas. Portanto, as alterações na expressão da proteína Caspase-3 no tecido pulmonar de ratos podem também responder directamente à apoptose no tecido pulmonar. Para compreender melhor o mecanismo e as vias de acção da apoptose induzida por OLV, investigámos as alterações da expressão da proteína Caspase-3 por immunoblotting. A partir dos resultados experimentais, as alterações na expressão da proteína Caspase-3 e as alterações na apoptose detectadas pela TUNEL foram geralmente consistentes, confirmando assim os resultados do ensaio da TUNEL.
Em conclusão, com o prolongamento do tempo de ventilação, a OLV pode levar a alterações na estrutura do tecido pulmonar e aumentar a expressão da apoptose e o seu factor de execução da proteína Caspase-3, pelo que se especula que a apoptose pode ser um importante factor de lesão pulmonar causada pela OLV. No entanto, são necessários mais estudos sobre o mecanismo de acção mais específico.
REFERÊNCIAS
[1] Zhao B, Zhang H R, Li H M et al. A relação entre a lesão pulmonar relacionada com a ventilação mecânica e a apoptose no tecido pulmonar em ratos[J]. Chinese Journal of Practical Medicine,2011,38(3):50-52.
[2] Plataki M, Hubmayr RD. The physical basis of ventilator-induced lung injury[J]. Expert Rev Respir Med,2010, 4(3): 373-385.
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[4] Chopra M,Reuben JS,Sharma AC.Acute Lung Injury:Apoptosis and Signaling Mechanisms[J] .Experimental Biology and Medicine,2009,234:361-371.
[5] Krick S, Eul BG, Hanze J,et al. Role of hyppoxia-inducible factor-1alpha in hyppoxia-induced apoptosis of primary alveolar epithelial type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol 2005;32:395C403.
[6] den Hengst Willem A., Gielis Jan F., Lin Judy Y.,et al. Lung ischemia-reperfusion injury: a molecular and clinical view on a complex pathophysiological process[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,299(5):H1283-1299.
[7] You CJ, Xu HX, Zhou ZC et al. Effect of single-lung ventilation at different times on the level of oxidative stress in the lungs[J]. Medicina geral chinesa,2010(12):1492-1493.
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[9] Um S,Hishikawa Y,Liu J,et al. Lesão pulmonar após isquemia-reperfusão do intestino delgado em ratos envolve apoptose de células epiteliais alveolares tipo II mediadas por TNF-alfa e activação da via de Bid[J].Apoptose,2007,12(11):1989-2001.
[10] Hammerschmidt S,Kuhn H,Grasenack T,et al. Apoptose e necrose induzidas por estiramento mecânico cíclico em células alveolares do tipo II[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2004,30(3):396-402.