Para determinar a distribuição de células estaminais epiteliais na membrana timpânica, as alterações das células estaminais após perfuração da membrana timpânica, as características de crescimento em cultura in vitro de diferentes partes do epitélio timpânico, e para estabelecer um método de cultura in vitro e proliferação de células estaminais do tímpano. Quatro ratos SD jovens e quatro ratos SD adultos foram observados com membranas timpânicas normais, e 28 ratos adultos foram perfurados com uma tensão central da membrana timpânica de 2 mm. Secções congeladas das membranas do tímpano foram tomadas em momentos diferentes após perfuração e examinadas imunohistoquimicamente para β1 integrina e queratina 19. 30 membranas do tímpano de ratos adultos SD foram danificadas com mitomicina C. A superfície da mucosa foi dividida em duas partes, o epitélio do anel timpânico e o epitélio central tenso, e os tempos de proliferação celular foram comparados entre o anel timpânico e o epitélio central tenso. As células do tímpano foram classificadas de acordo com o tempo de aposição, usando 1 hora como critério. As células queratinas 19 e β1 integrin-positivas foram distribuídas no anel timpânico e na região do talo do martelo na secção tensa, dispersas na secção flácida, e ausentes na secção tensa central. Não houve diferença entre ratos jovens e adultos. O número de células positivas no anel timpânico e no talo ósseo do martelo aumentou após a perfuração aguda da parte tensa, e não houve nenhuma coloração positiva na borda da perfuração. As culturas in vitro de células epiteliais do anel timpânico levaram significativamente menos tempo a multiplicar-se do que o epitélio central da extremidade tensa, e as células que aderiram à parede dentro de 1 hora estavam a crescer activamente, produzindo colónias maiores ricas em células estaminais epiteliais. As células estaminais epiteliais foram distribuídas no anel timpânico e martelar regiões do talo ósseo na parte tensa da membrana timpânica, sem células estaminais na parte central da parte tensa. No meio de cultura apropriado, as células estaminais proliferaram bem e poderiam ser purificadas inicialmente pelo tempo de aposição.