A maioria das verrugas pode ser diagnosticada a olho nu, mas algumas não podem ser diagnosticadas clinicamente durante algum tempo e dependem de reagentes de laboratório ou outros reagentes para fazer o diagnóstico, tais como as verrugas planas, que requerem um teste serológico de sífilis. Apresentamos a seguir alguns dos testes mais utilizados.
O facto real é que poderá obter muito mais do que apenas alguns dos mais populares e mais populares.
O principal objectivo do teste do ácido acético é detectar a infecção subclínica por HPV, especialmente em mulheres com infecção subclínica por HPV cervical. É adequado para estudos clínicos e epidemiológicos gerais devido à sua boa sensibilidade e simplicidade.
Está bem documentado que as infecções subclínicas por HPV são muito mais comuns do que as lesões clinicamente significativas e só podem ser detectadas através de métodos específicos. As infecções subclínicas por HPV são inicialmente encontradas no colo do útero e mais tarde na vulva feminina, no pénis masculino e na área perianal. As infecções subclínicas por HPV podem ser encontradas sozinhas ou sob a forma de verrugas visíveis a olho nu. Nos últimos anos, vários estudos confirmaram a associação entre a infecção por HPV e a neoplasia, pelo que a infecção subclínica por HPV tem recebido cada vez mais atenção. Existem vários métodos laboratoriais para detectar a infecção por HPV, incluindo métodos imunológicos, técnicas de hibridação molecular de ácido desoxirribonucleico e reacção de enzimas polimórficas em cadeia. Os testes serológicos ainda não estão disponíveis e o HPV não pode ser cultivado. Embora os métodos experimentais acima referidos tenham alguma sensibilidade e especificidade, são difíceis de aplicar na prática clínica e epidemiológica em geral porque requerem equipamento e técnicas laboratoriais mais complexas. Nos últimos anos, alguns estudiosos sugeriram a utilização da capacidade do ácido acético para branquear áreas infectadas por HPV para detectar infecções subclínicas por HPV, sugerindo que este método, quando combinado com técnicas de amplificação, seria um método mais simples, mais aplicável e mais preciso. Embora este método tenha sido utilizado pela primeira vez para identificar áreas suspeitas de infecção por HPV no colo do útero feminino, mais recentemente o interesse mudou para a detecção de danos subclínicos em parceiros sexuais masculinos de mulheres com lesões de verrugas genitais ou crescimento intra-epitelial. Numa investigação recente, 72% dos 51 parceiros sexuais masculinos de mulheres com manifestações histológicas de condiloma acuminato foram identificados pela colposcopia como tendo uma infecção assintomática por HPV após aplicação de solução de ácido acético a 5% na pele normal da superfície do pénis.
Método e lógica
Um cotonete mergulhado em 3% a 5% de solução de ácido acético foi aplicado à pele suspeita de ter sido danificada e o resultado do branqueamento (também conhecido como acetato branco – acetonhite) foi geralmente observável após 1 minuto. No entanto, na vulva feminina, o branqueamento do ácido acético só pode ser observado após 3 a 5 minutos. Nos homens, quando examinados, o pénis e o escroto devem ser cobertos com 3% a 5% de gaze embebida em ácido acético durante 3 a 5 minutos, e depois a pele externa deve ser observada com uma ampliação de 10 a 16 vezes para procurar verrugas escondidas ou áreas de clareamento com ácido acético. Um período de tempo mais longo, geralmente 15 minutos, pode ser necessário para branquear a lesão perianal com confiança. O teste do acetato branco foi melhorado através do uso de técnicas de ampliação e especialmente o uso simultâneo da observação colposcópica, o que torna a área de acetato branco mais visível com ampliação colposcópica, mas na maioria dos casos o uso de uma lupa simples é suficiente.
O mecanismo de acção do teste do acetato branco, que torna visíveis a olho nu verrugas inconspícuas, não foi clarificado. Uma teoria sugere que o branqueamento é o resultado da coagulação de proteínas, e que esta proteína reflecte as células anormais e os excessos celulares característicos do epitélio infectado com HPV. Outra teoria postula que o epitélio infectado com HPV tem queratina diferente do epitélio normal não infectado e que apenas o primeiro pode ser branqueado por ácido acético.
Apresentação em colposcopia
Após a utilização de ácido acético, as características colposcópicas da infecção subclínica por HPV do colo do útero são lesões brilhantes, brancas de neve com margens irregulares, angulares ou emplumadas. Existem lesões difusas por satélite para além da área metastásica, enquanto se podem ver imagens capilares, geralmente constituídas por vasos do mesmo calibre num arranjo solto e desorganizado que muitas vezes se assemelham a uma peneira numa superfície horizontal, e colaterais capilares dilatados podem também estender-se verticalmente à superfície, espalhando-se ao longo da lesão com o mesmo diâmetro de canal. Se a imagem vascular não for suficientemente clara devido à constrição de pequenos vasos induzida por ácido acético, um filtro verde pode ser acrescentado à lupa para tornar a imagem mais clara.
Tal como na colposcopia cervical, a zona branca de ácido acético da infecção genital masculina por HPV é brilhante, branca de neve e brilhante na colposcopia. É de notar que 22% das infecções subclínicas por HPV nos homens ocorrem no escroto, que pode ser um local importante de transmissão do HPV, uma vez que pouca atenção é dada a esta área anatómica como possível refúgio para o HPV. Wikstrom classificou a apresentação do acetato branco nos genitais masculinos em três tipos, dependendo da ampliação.
1. típico: são visíveis danos marginais facilmente distinguíveis, ligeiramente elevados, bem como capilares centrais perfurados associados ou não relacionados com depressões epiteliais.
2. danos distintos, visíveis, com margens facilmente distinguíveis, ligeiramente elevadas, mas sem capilares de punção distintos.
3. atípico: danos que mostram uma margem elevada e irregular e falta de capilares puntiformes.
Aplicação clínica
O inquérito do Wikstrom mostrou que 62% das infecções típicas e óbvias por HPV no teste do acetato branco eram consistentes com os resultados histopatológicos. Em contraste, apenas 11% das apresentações atípicas foram consistentes. Quando baseado nos resultados histopatológicos, a sensibilidade do teste do acetato branco é de 85% e a especificidade é de 12%. Se se basear em técnicas de mancha de ácido nucleico e hibridação in situ, a sensibilidade é de 85% e a especificidade de 11%. Devido à sensibilidade do teste do acetato branco e à simplicidade do método, que não requer instrumentação complexa, é adequado para estudos clínicos e epidemiológicos gerais.
O teste do acetato branco é utilizado principalmente na prática clínica para detectar infecções subclínicas por HPV. Como a maioria das infecções cervicais por HPV nas mulheres são subclínicas, só são visíveis com o uso de ácido acético. Nas mulheres, o condiloma vulvar é comum, mas é frequentemente combinado com infecção subclínica, pelo que a utilização do teste de acetato branco na vulva para detectar infecção subclínica por HPV pode identificar a fonte de condiloma recorrente. Em segundo lugar, é possível reconhecer a infecção subclínica por HPV como uma possível causa de prurido vestibular anteriormente inexplicado, sensação de ardor e desconforto durante a relação sexual, o que pode ser muito angustiante para o doente. Esta última condição é geralmente de longa duração e pode ser mal diagnosticada como uma infecção por Candida, que só pode ser exacerbada por um tratamento prolongado e ineficaz.
A infecção subclínica por HPV dos genitais masculinos pode causar lesões pequenas e não palpáveis que não são facilmente visíveis a olho nu, particularmente pápulas e lesões fragmentadas, que são difíceis de detectar mesmo num exame muito detalhado e podem aparecer como “áreas de clareamento com ácido acético” bem definidas com a utilização de ácido acético. O rastreio da infecção subclínica por HPV em homens de alto risco é importante para a prevenção do cancro do colo do útero nas mulheres. Tem sido sugerido que os homens com infecção por HPV clinicamente insignificante podem ser uma fonte de HPV potencialmente causadora de cancro nas mulheres. Num inquérito realizado em Londres a 75 parceiros sexuais masculinos de mulheres com neoplasia intra-epitelial cervical diagnosticada histologicamente (CIN grau III), constatou-se que 49 (65%) tinham infecção por HPV no pénis confirmada histologicamente, 16% apresentavam danos clinicamente visíveis, e 49% tinham infecção subclínica por HPV confirmada por teste de acetato branco e colposcopia.
A infecção subclínica por HPV é comum e alguns casos identificados por testes com acetato branco devem, em princípio, ser tratados, mas isto é difícil de fazer na prática. Actualmente, a maioria dos clínicos só tenta remover verrugas visíveis a olho nu e não tem o cuidado de identificar danos subclínicos. O teste do acetato branco só é realizado em doentes com recidivas frequentes e quando se faz o rastreio de sexo em doentes com aparência clínica normal.
A primeira delas é a utilização do termo “peroxidase”.
O teste é geralmente feito pelo método antiperoxidase peroxidase (ou seja, PAP), que mostra as proteínas virais dentro das verrugas para demonstrar a presença de antigénios virais nos danos causados pela verruga.
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Uma pequena quantidade de tecido é retirada e corada com anticorpos específicos para o vírus do papiloma humano. Se os antigénios virais estiverem presentes na lesão, a combinação antigénio-anticorpo está presente. No método da peroxidase-anti-peroxidase (PAP), o núcleo pode estar manchado de vermelho. Este método é específico e relativamente rápido e é útil para o diagnóstico.
IV. Exame patológico
As principais características são queratinização incompleta, hipertrofia elevada da camada espinhosa, hiperplasia papilomatosa, espessamento e prolongamento das saliências epidérmicas, que podem assemelhar-se a hiperplasia pseudo-epiteliomática. As células espinhosas e as células basais têm uma quantidade considerável de divisão nuclear e assemelham-se a um carcinoma. No entanto, as células são dispostas regularmente e a fronteira entre o epitélio proliferante e a derme é clara. Caracteriza-se pela formação de vacúolos distintos na camada granular e na parte superior da camada espinhosa. Estas células vacuoladas são maiores do que o normal, com um citoplasma ligeiramente colorido e um núcleo central grande, redondo e profundamente basofílico. O condiloma gigante Bushke-loewenstein, com o seu crescimento epidérmico descendente extremo, substitui o tecido subjacente e é facilmente confundido com células escamosas, pelo que são necessárias múltiplas biópsias. Se existe uma tendência para uma progressão lenta, este é um processo maligno de baixo grau, conhecido como carcinoma verrucoso.
V. Diagnóstico genético
Até à data, o HPV tem sido difícil de detectar utilizando a cultura viral tradicional e técnicas serológicas, e a principal técnica de diagnóstico é a hibridação do ácido nucleico. O método PCR desenvolvido nos últimos anos tem as vantagens da especificidade, sensibilidade, simplicidade e rapidez, abrindo novos caminhos para a detecção de HPV.
(i) Recolha e processamento de espécimes
1. recolha de espécimes e pré-tratamento: As secreções e células são retiradas da vagina e ectocérvix com um raspador ou esfregaço de algodão infiltrado com soro fisiológico. Ao fazer o exame citológico, a amostra é colocada em 5 ml de PBS contendo 0,05% de timerosal, lavada duas vezes com PBS por centrifugação (3000 g, 10 min), as células depositadas são ressuspendidas em 1 ml de PBS e 0,5 ml de suspensão celular é retirado para extracção de ADN.
2. extracção de ácidos nucleicos de amostras: 1 volume de suspensão celular mais 10 vezes o volume de solução de lise celular (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 10 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 0,4% SDS, 1,0 mg/ml de proteinase K) foi tratado durante a noite a 37°C; e volumes iguais de fenol/clorofórmio (1:1), clorofórmio/iso (24:1) cada duas vezes; adicionar 1/10 volume de 3 mol/L NaAc (pH 5,2) e 2,5 vezes o volume de etanol anidro a -20°C durante 2h ou durante a noite para precipitar o ADN; lavar uma vez com 1 volume de etanol; lise com 60 μl de solução de TE (10 mmol/L Tris-HCl, pH 8,0, 1,0 mmol/L EDTA) e incubar durante 30 min a 37°C.
(II) Amplificação PCR
1. concepção e síntese da cartilha: O genoma HPV pode ser dividido numa região precoce (E) e numa região tardia (L), cada uma contendo uma série de quadros de leitura abertos (ORFs). A análise das sequências mostrou que existem sequências conservadas nas regiões não codificadas de cada tipo de HPV e nas regiões E1, E6, E7 e L1. Manos et al. conceberam primários sintéticos MY11 e MY09 a partir das sequências conservadas na região L1 de HPV, como mostra a Tabela 1, que têm sequências complementares com os tipos HPV 6, 11, 16, 18 e 33 e podem também amplificar outros tipos de HPV.
2. reagentes de reacção PCR: Taq DNA polimerase (2 U/ml), reservatório 10 mmol/L dNTP (10 mmol/L cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 10× tampão PCR (500 mmol KCl, 40 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L Tris-HCl, pH 8,5), 100 μmol/L reservatórios MY11 e MY09, e água destilada preparada em alambiques de vidro esterilizado.
3. método e procedimento de amplificação por PCR: 100 μl Foi utilizada uma solução de reacção por PCR em tubos de centrifugação plásticos siliconizados estéreis de 0,5 ml para a reacção de amplificação.
(1) Os reagentes de reacção pré-misturados foram preparados e dispensados antes da experiência. Os reagentes pré-misturados incluem todos os tipos de reagentes PCR excepto amostras de ADN.
(2) Acrescentar 10 μl de amostra e 90 μl de reagente de pré-mistura a cada tubo por sua vez.
(3) Adicionar rapidamente 80-100μl de óleo parafínico e centrifugar durante alguns segundos numa centrifugadora de bancada para permitir que cada reagente de reacção se recolha sob a camada de óleo. Os reagentes PCR estão agora comercialmente disponíveis em volumes de 25 μl, e apenas a amostra de ADN é adicionada.
(4) Colocar o tubo de reacção no instrumento de amplificação PCR com parâmetros de ciclos de 95°C para 30s, 55°C para 40s, 72°C para 50s para 35 ciclos, e finalmente 72°C para 5min de extensão.
4. controlos positivos e negativos devem ser estabelecidos para cada teste. Plasmídeo recombinante contendo HPV (100pg por reacção) ou linha celular contendo ADN HPV (por exemplo, Caski, HeLa) como controlo positivo, e ADN da linha celular humana sem HPV como controlo negativo.
(iii) Detecção e análise de produtos de amplificação
1.Gel electroforese: Após a reacção de amplificação, remover o tubo de reacção, arrefecer à temperatura ambiente, tomar 10μl do produto de amplificação e electroforese com gel de poliacrilamida 5%-7% ou 1,5% de agarose, corar com brometo de etídio, analisar os resultados sob analisador UV, a banda de ADN parece evidente ao peso molecular de cerca de 450bp.
2. hibridação do ácido nucleico: Se não houver ADN claro por electroforese em gel ou se for necessário determinar a especificidade da banda de ADN, pode ser utilizada uma sonda mista comum rotulada e/ou uma sonda específica do tipo para a hibridação “Southern blot” e verificação da hibridação “speckle hybridisation”.
Uma sonda de oligonucleótido com 32P ATP deve ser feita de acordo com métodos padrão e deve ter uma actividade específica de aproximadamente 107 cpm/pmol. A solução de hibridação deve conter 2 x 106-5 x 106 cpm sonda/ml. A hibridação é realizada a 55°C durante 2-3h com agitação lenta, seguida de lavagem rápida da membrana hibridizada com solução de lavagem (2 x SSC, 0,1% SDS) a 30-55°C para remover o excesso de sonda. A membrana foi então lavada em condições diferentes dependendo das sondas utilizadas: para as sondas híbridas comuns, a membrana foi lavada a 55°C durante 10 min; para as sondas MY12, MY13 e MY16, a membrana foi lavada a 56-57°C durante 10 min e lavada uma vez com uma mudança de solução; para as sondas MY14 e WD74, a membrana foi lavada a 58-59°C durante 10 min e também lavada uma vez com uma mudança de solução.
A detecção de HPV por PCR é superior aos métodos de hibridação do ácido nucleico. A sua sensibilidade é elevada. O método GP-PCR pode detectar 200 cópias de ADN HPV na amostra através da análise directa dos resultados por electroforese em gel, enquanto que se o produto PCR for detectado por hibridação do ácido nucleico, a sensibilidade é aumentada e podem ser detectadas 10 cópias de ADN HPV.
Dada a alta sensibilidade da técnica PCR, a utilização de células esfoliadas do tracto genital é suficiente para satisfazer os requisitos do teste, evitando a necessidade de biopsia do material e de moer o tecido. Em geral, o produto de amplificação PCR é submetido a electroforese em gel e o ADN resultante pode ser observado para fazer um diagnóstico directo. Portanto, a técnica de PCR para a detecção de HPV é curta, simples e rápida.