Investigar os efeitos dos grânulos de Gongqing na apoptose celular e na transdução de sinais nas vilosidades coriónicas e no tecido da muda no início da gravidez humana e fornecer uma base biológica para a prevenção e o tratamento clínicos da hemorragia uterina anormal após o aborto medicamentoso (referida como hemorragia pós-aborto medicamentoso). Methods: 120 subjects were randomly divided into 30 cases each in Gongqing drug abortion group, Xizhi drug abortion group, simple drug abortion group and negative pressure suction group, and the chorionic villi and moult tissues of each group were collected to observe the ultrastructural changes of the cells; apoptosis rate (AR) was detected by the TUNEL method, the concentration of intracellular calcium ions ([Ca2+]i)(Ca2+)(Ca2+)(Ca2+)(i)(Ca2+)(i)(ii)(iii)(Ca2+) was determined by the fluorescence spectrophotometer, and the protein expression of protein kinase C(PKC)（PKC）(PKC)(PKC) was determined by immunohistochemistry. expressão da proteína. Resultados: A ultraestrutura das vilosidades coriónicas e das células de metamorfose no grupo de aborto Miyagi mostrou alterações apoptóticas típicas, com aumento de AR, [Ca2 +] i e diminuição da expressão da proteína PKC, que foram estatisticamente significativas em comparação com os outros três grupos (P <0,05 ou P <0,01). Conclusão: Os grânulos de Gongqing podem afetar o Ca2+ intracelular e a transdução de sinais celulares mediada pela PKC, induzir a apoptose das vilosidades coriónicas e do tecido da muda no início da gravidez humana e promover a descarga completa das vilosidades coriónicas e do tecido da muda, prevenindo e controlando assim a hemorragia após o aborto medicamentoso. O aborto medicamentoso tem as vantagens de ser seguro e menos doloroso, mas existem problemas como o longo tempo de hemorragia, hemorragia intensa, etc. Em alguns casos, o tempo de hemorragia chega a ser de 1-4 meses, e existe uma taxa de aborto incompleto de 6%-10% e o risco potencial de hemorragia. A fórmula do medicamento chinês Gongqing Granules é uma fórmula eficaz que tem sido utilizada na prática clínica há muito tempo, tendo sido aprovada pela Administração Estatal de Medicamentos para a investigação clínica de novos medicamentos e tendo concluído com êxito o estudo clínico de fase II. Neste estudo, investigámos o mecanismo dos grânulos de Gongqing na prevenção e no controlo da hemorragia pós-aborto medicamentoso, na perspetiva da apoptose e da transdução de sinais, de modo a fornecer uma base biológica para a aplicação clínica e a enriquecer a conotação científica da teoria de "muitas deficiências e estagnação no período pós-parto" na medicina chinesa. Dados e Métodos I. Sujeitos Foram incluídos e excluídos 120 casos, todos atendidos na consulta externa de ginecologia do Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Shandong, de maio de 2006 a outubro de 2007, de acordo com os conteúdos da Obstetrícia e Ginecologia Chinesas, da Rotina de Diagnóstico e Tratamento de Obstetrícia e Ginecologia e das Directrizes para a Investigação Clínica das Novas Medicinas Tradicionais Chinesas. De acordo com a tabela de números aleatórios, os indivíduos foram divididos em grupo de aborto com o fármaco Gongqing (Grupo A), grupo de aborto com o fármaco Xi Zhi (Grupo B), grupo de aborto com o fármaco simples (Grupo C) e grupo de aborto por sucção com pressão negativa (Grupo D) através do método de agrupamento aleatório em dupla ocultação, sendo cada grupo constituído por 30 casos. Medicamentos e reagentes: a mifepristona (China National Drug Administration (CNDA) H20000628, lote n.º 050501) e o misoprostol (CNDA H10960144, lote n.º 050309) foram produzidos pela Shanghai Hualian Pharmaceutical Co. Ltd. (Aprovação de Investigação Clínica para Novos Medicamentos 2003L01386 da Administração Estatal de Medicamentos). O Grupo A tomou mifepristona e misoprostol de acordo com o método de rotina de aborto medicamentoso. Grupo B: A mifepristona e o misoprostol foram administrados no primeiro dia de aborto, 48g/d em 3 doses durante 3 dias. Grupo B: A mifepristona e o misoprostol foram administrados no primeiro dia de aborto, 15 cápsulas/d em 3 doses durante 3 dias. Grupo C: A mifepristona e o misoprostol foram administrados da forma habitual de aborto medicamentoso e não foram administrados medicamentos tradicionais chineses. 4. grupo D: aborto por sucção com pressão negativa. Análise histológica 1, coleta de material 30 casos cada de vilosidades coriônicas frescas e 20 casos cada de tecidos de mecônio descarregados após a ingestão de drogas nos grupos A, B e C, e 30 casos cada de vilosidades coriônicas e tecidos de mecônio obtidos durante a cirurgia no grupo D. Os materiais foram lavados com solução salina fisiológica imediatamente e fixados convencionalmente. 2 . Observação ao microscópio eletrônico de transmissão da ultraestrutura celular Incorporação de resina epóxi (812), máquina de corte ultrafina, espessura de cerca de 60 nm, coloração dupla de acetato de dioxiranil e citrato de chumbo, observação ao microscópio eletrônico de transmissão JEM-1200EX e fotografias. 3, método TUNEL para detetar AR celular Depois que as seções da amostra foram coradas com HE, desparafinizadas, incubadas com proteinase K à temperatura ambiente por 20 min; 50 μl da mistura de reação TUNEL foram adicionados gota a gota e incubados em uma caixa úmida a 37 ℃ por 60 min; 50 μl de agente transformador POD foram adicionados e incubados a 37 ℃ por 30 min; as seções foram desidratadas, clarificadas e seladas por DAB, coloração nuclear de hematoxilina. Todas as etapas acima foram lavadas com PBS, e o controle negativo foi incubado com solução de reação TUNEL sem desoxinucleotidil transferase terminal. Análise quantitativa da imagem: Os reagentes TUNEL-positivos localizavam-se no núcleo e apareciam com uma cor amarelo-acastanhada, e as células com cor positiva eram células apoptóticas [6]. Foram seleccionados aleatoriamente dez campos de visão não sobrepostos (×100) e a percentagem de células positivas foi AR. 4. Deteção de [Ca2+] por espetrofotómetro de fluorescência i A grelha de excitação foi regulada para 5 nm, a grelha de emissão para 10 nm e a temperatura de medição foi de 37°C num espetrofotómetro de fluorescência Hitachi F-4500. Os espectros de excitação da solução padrão de Fura-2/AM e da solução de carga foram medidos espectroscopicamente, e os seus comprimentos de onda máximos diminuíram de 380 nm para 340 nm, indicando que a carga de Fura-2/AM entrou nas células. A intensidade de fluorescência (valor F) da solução de carregamento de Fu-ra-2 foi determinada de forma temporal (comprimento de onda de excitação de 340 nm) através da adição de 10% de TritonX-100 a uma concentração final de 0,1%, tendo a intensidade máxima de fluorescência Fmax sido detectada após 30 minutos e a intensidade mínima de fluorescência Fmin sido medida após 30 minutos através da adição de EDTA a uma concentração final de 5 mmol/,l. A [Ca2+] i( nmol / L) = Kd (F-Fmin / Fmas-F), Kd é a constante de dissociação para a reação entre Fura-2 e Ca2 +, 224nmol / L a 37 ℃. 5, Imunohistoquímica para detetar as alterações da expressão da proteína PKC celular As secções das amostras foram desparafinadas, incubadas com 3% de H O à temperatura ambiente durante 10min; enxaguado e reparado por antígenos de forno de micro-ondas; 10% de soro de cabra normal foi fechado e adicionado com anticorpo primário. Após enxaguamento, as fatias foram incubadas com anticorpo secundário marcado com enzima de rábano durante 30 minutos a 37 ℃; após o desenvolvimento da cor com cromogénio DAB, as fatias foram enxaguadas com água da torneira, reestanhadas e seladas. Os resultados foram analisados pelo software de análise de imagem Leica QW in V3, e verificou-se uma correlação negativa entre a força da expressão proteica e o tamanho da escala de cinzentos, ou seja, quanto mais forte a expressão proteica, menor a escala de cinzentos. V. Métodos estatísticos Foi utilizado o software estatístico SPSS12.0 e os resultados dos dados de medição foram expressos em média ± desvio-padrão (± s), tendo sido utilizado em primeiro lugar o teste do qui-quadrado da variância e, em seguida, o teste q e o teste da soma das classificações para a comparação das diferenças entre os grupos, tendo sido utilizado o teste x2 para os dados de contagem. Resultados I. Condições gerais Após análise estatística, as diferenças entre os quatro grupos em termos de idade, fertilidade, dias de menopausa e tamanho dos sacos gestacionais não foram estatisticamente significativas e eram comparáveis. Observação ultra-estrutural das vilosidades coriónicas e das células metafásicas (Figura 1) Grupo D. A superfície dos trofoblastos coriónicos e das células metafásicas era rica em microvilosidades, a membrana basal dos trofoblastos era normal, os núcleos dos trofoblastos e das células metafásicas apresentavam uma morfologia normal, a cromatina no núcleo estava uniformemente distribuída, os organelos eram normais, havia um grande número de grânulos secretores com elevada densidade eletrónica nas células da granulosa e a ligação intercelular era estreita. Grupo C. As microvilosidades superficiais dos trofoblastos e das células metafásicas estavam destacadas, a membrana basal dos trofoblastos estava espessada, os núcleos dos trofoblastos e das células metafásicas eram irregulares, a membrana nuclear estava inchada e havia alterações morfológicas apoptóticas, como a aglomeração de eucromatina, a coleção de heterocromatina e a condensação nuclear. As células da granulosa apresentavam uma diminuição acentuada dos grânulos endócrinos e um alargamento das junções intercelulares. Grupo B. As alterações ultra-estruturais dos sinciciotrofoblastos, citotrofoblastos, células metafásicas e células da granulosa foram semelhantes às do Grupo C. O Grupo B apresentou alterações morfológicas apoptóticas. O grupo A apresentou alterações morfológicas de apoptose, que foram mais graves do que as dos grupos C e B. Vesículas apoptóticas típicas, contendo organelas com estrutura normal, apareceram em sinciciotrofoblastos, citotrofoblastos, células metafásicas e células da granulosa. Alterações do RA, da [Ca2+] i e da PKC no grupo A, o RA e a [Ca2+] i dos trofoblastos coriónicos e das células metafásicas aumentaram, e o valor cinzento da PKC das células coriónicas e metafásicas aumentou, e as diferenças foram estatisticamente significativas em comparação com os outros três grupos (P<0,05), o que mostrou que a expressão da proteína PKC no grupo A estava reduzida em comparação com os outros grupos. Tabela 1 Alterações de RA, [Ca2+]i e PKC em células trofoblásticas cromafins(±s) Grupo Número de casos RA(%) [Ca2+]i PKC valor cinzento Grupo A 30 3,02±0,20*▲▲△ 125,37±6,40*▲△△ 135,71±3,82*▲△ Grupo B 30 2,89±0,19* 120,33±7,58* 133,73± 3,81* Grupo C 30 2 2,89±0,19* 120,33±7,58* 133,73± 3,81* Grupo B 30 2,89±0,19* 120,33±7,58* 133,73± 3,82 3,81* Grupo C 30 2,87±0,21* 119,91±6,80* 133,17±3,70* Grupo D 30 2,17±0,23 109,03±7,84 127,51±3,73 *P<0,01 comparando com o Grupo D ▲P<0,05 comparando com o Grupo C ΔΔΔΔ comparando com o Grupo B ΔΔΔΔ comparando com o Grupo C ΔΔΔ comparando com o Grupo B Grupo B P<0,01 Tabela 2 Alterações na RA, [Ca2+] i e PKC das células do tecido da decídua ( ±s) Grupo Número de casos RA (%) [Ca2+] i PKC valor da escala de cinza Grupo A 20 3,13±0,18*▲△ 130,65±7,46*▲△ 142,80±4,93*▲△ Grupo B 20 3,02±0,14* 125,14±8,04 * 139,17±4,94* Grupo C 20 2,99±0,19* 124,42±7,96* 138,25±5,18* Grupo D 30 2,83±0,15 110,31±7,53 131,45±4,03 *P<0,01 vs. Grupo D ▲P<0,05 vs. Grupo C △P<0,05 vs. Grupo B DISCUSSÃO Estudos recentes concluíram que. A hemorragia uterina anormal após o aborto medicamentoso está relacionada com a apoptose insuficiente das vilosidades coriónicas e das células da muda, e as células das vilosidades coriónicas e dos tecidos da muda após a ação da mifepristona mostraram tendência apoptótica, e os resultados do presente estudo são consistentes com o relatório. Está provado que a medicina tradicional chinesa pode regular a apoptose, ativar a circulação sanguínea e eliminar a estagnação sanguínea pode induzir a apoptose e regular o equilíbrio entre a proliferação celular e a apoptose, e que o calor purificador e a medicina tónica podem induzir a apoptose das células tumorais, mas ainda não existe qualquer relatório de investigação sobre a medicina tradicional chinesa que induza a apoptose das vilosidades coriónicas e da ecdise no início da gravidez humana para prevenir a hemorragia pós-aborto medicamentoso. No presente estudo, observámos as alterações ultra-estruturais das vilosidades coriónicas e das células do tecido da muda em quatro grupos de mulheres após o aborto, e verificámos que o grau de apoptose das vilosidades coriónicas e das células do tecido da muda nos grânulos de Gongqing utilizados no aborto medicamentoso era superior ao dos outros três grupos, e que a RA das vilosidades coriónicas e da muda neste grupo era significativamente superior à dos outros grupos, sugerindo que os grânulos de Gongqing tinham o efeito de induzir a apoptose das vilosidades coriónicas e das células da muda no aborto medicamentoso em gravidezes precoces humanas. A fim de explorar melhor este mecanismo de ação dos grânulos de Gongqing, estudámos o segundo mensageiro Ca2+ e a sua importante molécula alvo, a proteína PKC, que é a chave das actividades vitais celulares. O Ca2+ é o centro de várias vias de sinalização celular, e há provas de que o [Ca2+]i elevado pode causar apoptose. Nos últimos anos, foram realizados estudos aprofundados sobre a apoptose em abortos induzidos por fármacos, mas não foram comunicados estudos sobre a sobrecarga de Ca2+, um fator importante envolvido na transdução de sinais apoptóticos. Pela primeira vez, incluímos a [Ca2+]i no estudo do efeito dos fármacos abortivos na apoptose e verificámos que a [Ca2+]i das vilosidades coriónicas e do mecónio era elevada pelos grânulos de Gongqing, sugerindo que os grânulos de Gongqing podem induzir a apoptose nas vilosidades coriónicas e no mecónio do início da gravidez humana, afectando a transdução de sinais mediada por Ca2+. Na via de sinalização, a PKC é uma proteína-alvo importante para a ação do Ca2+ intracelular e desempenha um papel importante no crescimento, diferenciação e apoptose das células. A ativação da PKC medeia uma variedade de efeitos biológicos através da fosforilação de resíduos de serina/treonina de moléculas de proteínas-alvo, o que pode reduzir a ativação da proteína G devido à fosforilação, provocando um aumento dos níveis de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) e induzindo a apoptose. Foi também referido que a ativação da PKC induz um aumento do nível de AMPc intracelular, que promove a transcrição, conduzindo à proliferação e diferenciação celular. Verificou-se que a mifepristona inibia a via de transdução de sinal da PKC e a cadeia cinase da cascata raf-1 e a proteína activadora da divisão nas células trofoblásticas do início da gravidez, inibia a proliferação e a divisão e induzia a apoptose. Neste estudo, descobrimos que a expressão da proteína PKC nas células trofoblásticas coriónicas e nas células do tecido metafásico foi reduzida após o aborto medicamentoso, sugerindo que os pellets de Gongqing podem inibir a diferenciação celular e o valor acrescentado e induzir a apoptose, reduzindo a expressão da proteína PKC. A medicina chinesa acredita que o aborto medicamentoso é a interrupção artificial da gravidez, o yin e o sangue do aborto medicamentoso enfraquecem subitamente, o gás não absorve o sangue; ou o aborto não está completo, o útero estagnado de sangue remanescente, a estase de sangue não desaparece, é difícil para o novo sangue estar seguro; ou os males externos atacados pela produção de calor, lesões de calor no sangue; ou os três estão interligados, coexistindo com o real e o virtual, resultando na descarga impura. "A estase sanguínea, a deficiência e o calor são os principais mecanismos desta doença, a ativação da circulação sanguínea para eliminar a estase sanguínea é a chave para o tratamento desta doença, e a circulação sanguínea será realizada quando a estase sanguínea for eliminada, e nutrir o sangue e beneficiar o qi é a base do tratamento desta doença. Materia Medica, the principal medicine of Gongqing Granules, activates blood circulation and removes blood stasis, clears heat and stops bleeding; the ministerial medicines, Amaranthus, Radix et Rhizoma Gastrodiae, Radix Achyranthis Bidentatae, Radix Achyranthis Bidentatae, help the principal medicine to activate blood circulation and remove blood stasis, cools blood circulation and stops bleeding; the adjuvants, Radix Angelicae Sinensis, Radix Codonopsis Pilosulae, nourish blood and benefit the vitality of qi and activate blood circulation and remove blood stasis; and the medicine, Glycyrrhiza Glutinosa, tonifies and benefits qi and regulates the medicines; experiments have confirmed that this medicine can synergize with Mifepristone in anti-early pregnancy and increase the rate of complete miscarriage, shorten the time of vaginal bleeding, reduce vaginal bleeding, and does not influence the function of ovarian ovulation or the restoration of menses. As experiências farmacodinâmicas mostraram que os grânulos de Gongqing podiam estimular significativamente o músculo liso uterino, encurtar o tempo de coagulação, aumentar o teor de estrogénio, ter efeitos antibacterianos e analgésicos, e verificaram que o fármaco tem tendência para induzir a apoptose das células coriónicas. Verificou-se que esta fórmula pode induzir a apoptose das células das vilosidades coriónicas e do tecido da muda no início da gravidez humana, promover a descarga completa das vilosidades coriónicas e do tecido da muda, prevenindo e controlando assim a hemorragia após o aborto medicinal. A regulação da sinalização celular mediada por Ca2+ e PKC pode ser um dos seus mecanismos de ação. No entanto, a fonte de Ca2+ intracelular e o seu mecanismo exato na indução da apoptose das vilosidades coriónicas e dos tecidos equimóticos ainda não foram esclarecidos, e uma investigação aprofundada neste sentido revelará ainda mais a patogénese desta doença e o mecanismo de prevenção e tratamento medicamentoso.