I. Preparação pré-operatória
Tal como a preparação pré-operatória de broncoscopia fibrosa (fibronectomia), BAL é rotineiramente feita após a fibronectomia e antes da biópsia. A lidocaína a 2% é utilizada como anestésico local.
Técnica de operação de BAL
1.Selection do site de lavagens: Para doenças intersticiais difusas do pulmão, escolher o lobo médio direito (B1 ou B5) ou o segmento lingual esquerdo do pulmão, e para lesões pulmonares limitadas, realizar BAL no segmento broncopulmonar correspondente.
O líquido recuperado foi imediatamente filtrado através de uma dupla camada de gaze esterilizada para remover o muco, e a quantidade total foi registada; foi colocado num frasco de plástico de silicone ou num recipiente de vidro esterilizado revestido de silicone (para reduzir a adesão celular), colocado numa garrafa térmica contendo gelo, e enviado imediatamente para o laboratório. O muco foi imediatamente enviado para o laboratório para exame.
Testes de laboratório de fluido de lavagem broncoalveolar (BALF)
I. Contagem total de células BALF e detecção de contagem de células de triagem
1. O fluido de lavagem recuperado acima foi embalado em tubos de centrifugação de plástico e centrifugado a 1.200r/min durante 10min a 4 ℃, e o sobrenadante (solução de reserva ou concentrado 10 vezes) foi armazenado a 70 ℃ e utilizado para a detecção de componentes solúveis.
2. Os componentes celulares precipitados por centrifugação foram lavados duas vezes com a solução de Hank (sem Ca2+ e Mg2+) sob as mesmas condições, cada vez durante 5 min. Foram adicionados 3-5 ml de solução de Hank depois de o sobrenadante ter sido descartado para fazer a suspensão celular. A solução de lavagem também pode ser aplicada para reduzir a perda de células.
3. Contar o número total de células em BALF num contador Neubauer modificado, normalmente expresso em 1 × 109/L. Se a contagem de células for demasiado alta, a contagem de células deve ser aumentada. Se a contagem de células for demasiado alta, a contagem de células é ajustada para 5 × 109/L por diluição com a solução de Hank, e o tubo é imerso em gelo picado.
4. Separação de células: Utilizando um dispositivo de esfregaço centrífugo de células, adicionar 100 μl de suspensão de células de reserva (concentração de células de 5 × 109/L) e centrifugar a 1 200 r/min durante 10 min a 4 ℃ para espalhar um certo número de células BALF directamente na lâmina por centrifugação. As lâminas foram imediatamente secas com ar frio, fixadas em etanol anidro durante 30 min e depois coradas, geralmente com coloração Wright ou HE.
5.Count 200 células com menos de 40 vezes microscópio de luz para classificação de células.
Detecção de subpopulação de linfócitos T em BALF
1, Utilizando o método de imunofluorescência indirecta, os componentes celulares BALF acima obtidos foram transformados em suspensão celular com 3~5ml de meio de cultura RPMI 1640 soro de bezerro a 10%.
2.Pour a suspensão celular num prato plano e incubá-la durante 2h numa incubadora de 5% de CO2 a 37 ℃ para remover os macrófagos alveolares.
3, remover a suspensão celular, depois enxaguar com a solução de Hank e centrifugar uma vez, descartar o sobrenadante e deixar 20-100μl. Após o tratamento de parede, os macrófagos alveolares foram significativamente reduzidos e os linfócitos foram relativamente aumentados na suspensão celular.
4, a suspensão celular tratada na parede foi dividida em três pequenos tubos de centrifugação cónicos, 20-30μl por tubo, e 20-40μl de anticorpos monoclonais CD3, CD4 e CD8 foram adicionados à amostra com um microscópio, e misturados num frigorífico a 4 ℃ durante 1~2h.
5, remover a amostra, primeiro enxaguar com solução de Hank e centrifugar 2 vezes a 12 000 r/min durante 20s, depois adicionar 20-40μl de cada anticorpo anti-rato de cabra fluorescente e colocar num frigorífico a 4 ℃ durante 30min.
6. Retirar a amostra e enxaguá-la duas vezes por centrifugação com a solução de Hank à mesma velocidade e tempo, descartar o sobrenadante e deixar 20μl para misturar bem as células, tomar 1 gota na lâmina e lamela de cobertura. Contar 200 linfócitos sob o microscópio de fluorescência e calcular a taxa positiva das células rotuladas com fluorescência.
Algumas notas:
1. O diâmetro da ponta do fibrinoscópio utilizado para lavagem broncoalveolar deve ser cerca de 5,5-6,0 mm, e deve ser devidamente encravado no orifício brônquico do segmento ou sub-segmento para evitar a mistura de secreções das vias aéreas e o derrame de fluido de lavagem e para assegurar a recuperação de BALF.
2.The o reflexo da tosse deve ser adequadamente suprimido durante o processo de lavagem, caso contrário é fácil causar danos na parede brônquica e causar a mistura do líquido de lavagem, o que também afecta o volume de recuperação.
3, deve ser um espécime qualificado de BALF: BALF sem secreções atmosféricas misturadas; taxa de recuperação > 40%, as células sobreviventes foram responsáveis por mais de 95%; glóbulos vermelhos < 10% (excepto factores de trauma / hemorragia), células epiteliais < 3% ~ 5%; morfologia das células de esfregaço intacta, sem deformação, distribuição uniforme.
4. A diluição do fluido de revestimento alveolar varia devido a muitos factores que afectam a detecção de componentes solúveis no BALF, tais como volume de perfusão e volume de recuperação, permeabilidade do epitélio alveolar, etc. Embora sejam utilizados marcadores internos ou externos para a padronização de componentes solúveis em BALF, ainda existem diferenças nos resultados dos testes, e o seu valor clínico é limitado, pelo que este projecto não regula o método de detecção de componentes líquidos de BALF.
A especificação 5.This não é adequada para a operação de lavagem brônquica (BL) e técnicas de lavagem pulmonar integral com pequena quantidade de líquido.
6.The valores de referência normais do teste citológico de BALF em não fumadores saudáveis:
(1) Fração celular total: contagem total de células (0. 9-0. 26) × 109/L, incluindo macrófagos alveolares 0. 93 ± 0. 03, linfócitos 0. 07 ± 0. 01, neutrófilos e eosinófilos são < 0. 01.
(2) Subgrupos de linfócitos T: total de células T (CD3+) 0. 7, células T auxiliares (CD4+) 0. 5, células T supressoras (CD8+) 0,3, relação CD4+/CD8+ 1. 5 para 1. 8.