I. Método ABC (SP, LSAB, SABC método com os mesmos passos)
ABC (avidina-biotina comeplex) método do complexo ovalbuma-biotina pertence à técnica imuno-histoquímica da afinidade, de acordo com a propriedade biológica de alta afinidade da ovalbuma-biotina, a biotina peroxidase é obtida pela combinação da biotina com a peroxidase, e depois adiciona-se ovalbumina e biotina para formar o complexo ovalbuma-biotina-peroxidase. Enquanto a LSAB, S-P e SABC estão a utilizar a enzima de cadeia proteica antibiotina em vez da ovalbumina, e a enzima de cadeia proteica antibiotina (SA) rotulada com peroxidase em vez do complexo ABC, os passos são os mesmos, mas a velocidade de reacção é mais rápida devido ao menor peso molecular da SA e à melhor penetração. Além disso, a SA tem dois sítios de ligação com muito alta afinidade à biotina, e não tem biotina ligada a si mesma, que pode ligar-se à biotina no anticorpo secundário, pelo que é mais fácil de ligar com a biotina no anticorpo secundário do que o ABC, pelo que é mais sensível, e o complexo não precisa de ser misturado antes de ser utilizado, o que é mais simples e mais conveniente. O ABC é um método em três etapas, e o anticorpo secundário é a IgG biotinylated (ou IgM, IgA, etc.), em que o fragmento Fab Binding ao primeiro anticorpo, isto requer correspondência com o primeiro anticorpo. Se o primeiro anticorpo for um anticorpo de rato, o segundo anticorpo deve ser um anti-rato (ou IgM, IgA, etc.); se o segundo anticorpo for um anticorpo de coelho, o segundo anticorpo deve ser um anticorpo anti-coelho (ou IgM, IgA, etc.), bem como anticorpos de ovelha, rato, cavalo e outras fontes. Se for utilizado um anticorpo secundário universal de rato e coelho, não é necessário dividi-lo quando o anticorpo primário for rato ou coelho. O ABC é 20-40 vezes mais sensível do que o PAP devido à alta afinidade da ovalbumina e da biotina. Finalmente, a peroxidase no complexo reage com o desenvolvimento da cor para formar um precipitado de cor, que pode ser observado microscopicamente. O melhor agente cromogénico para a peroxidase é o DAB, que forma partículas castanhas insolúveis em água e pode ser desidratado com álcool e transparente com xileno; se o AEC for utilizado para o desenvolvimento da cor, gera-se um precipitado vermelho dissolvido em água, pelo que não pode ser desidratado e só pode ser selado com selante solúvel em água, o que não é bom para armazenamento a longo prazo.
Passos.
1.Slice desparafinação à água
2.Block peroxidase endógena (198 ml de metanol ou água + 2 ml 30% H2O2) no quarto
temperatura durante 20 min. Lavar com água.
3, reparação de antigénios: (1) pH 7,2 tampão TBS lavado três vezes, digestão com tripsina 37 ℃, 30 min. Ou (2) de acordo com as instruções: lavagem com água destilada, colocação em solução de reparação de antigénios (Ph6.0) dentro da reparação no microondas durante 20 minutos, ou aquecimento do forno eléctrico durante 30 minutos, ou autoclave com tampa fora de gás durante 3 minutos, arrefecimento rápido; ou (3) de acordo com as instruções: sem tratamento)
4, pH 7,2 TBS tampão de lavagem três vezes.
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5, adicionar soro normal gota a gota 37 ℃, 30 minutos.
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6, sacudir o excesso de soro, adicionar anticorpo primário 37 ℃, 30 minutos. Depois, adicionar o primeiro anticorpo durante 30 minutos.
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7.Wash três vezes com tampão TBS de pH 7,2.
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8, adicionar o anticorpo secundário gota a gota, 37 ℃, 30 minutos.
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9. Lavar três vezes com tampão TBS de pH 7,2.
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10. Adicionar o complexo ABC gota a gota, 37 ℃, 45 min.
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11, Lavar três vezes com tampão TBS de pH 7,2.
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12.DAB desenvolvimento da cor durante 3-10 min.
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13.Water lavagem.
14, coloração de luz hematoxilina, azulado, desidratação, transparência, selagem.
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II. Método PAP
Passos.
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1.Section desparafinação à água
2, bloqueio da peroxidase endógena (198 ml de metanol ou água + 2 ml 30% H2O2) em sala
temperatura durante 20 min. Lavar com água.
3, reparação de antígeno: (1) pH 7,2 tampão TBS lavado três vezes, digestão da tripsina 37 ℃, 30 min. Ou (2) de acordo com as instruções: lavagem com água destilada, colocação em solução de reparação de antigénios (Ph6.0) dentro da reparação no microondas durante 20 minutos, ou aquecimento do forno eléctrico durante 30 minutos, ou autoclave com tampa fora de gás durante 3 minutos, arrefecimento rápido; ou (3) de acordo com as instruções: sem tratamento)
4, pH 7,2 TBS tampão de lavagem três vezes.
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5, adicionar soro normal gota a gota 37 ℃, 30 minutos.
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6, sacudir o excesso de soro, adicionar gota a gota de anticorpos específicos 37 ℃ durante 30-60 minutos ou 4 ℃ durante a noite, colocar em caixa molhada.
7, lavagem PBS.
8.Add, anticorpos secundários gota a gota, 37 ℃, 30 minutos.
9, pH 7,2, tampão TBS lavado três vezes.
10, Adicionar anticorpo PAP 37 ℃, durante 30 minutos.
11, pH 7,2 TBS tampão lavado três vezes, desenvolvimento da cor DAB durante 3-10 minutos.
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12.Water wash.
13, coloração de luz hematoxilina, bluing, desidratação, transparente, selagem.
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III. Método APAAP
APAAP: Pertence ao método dos anticorpos não marcados, através do anticorpo anti-fosfátase alcalina com elevada especificidade e adição de uma grande quantidade de fosfátase alcalina ao anticorpo anti-enzima, de modo a que a fosfátase alcalina esteja totalmente ligada ao anticorpo anti-enzima para formar um complexo APAAP solúvel, o revelador de cor comummente utilizado é BCIP/NBT, vermelho sólido ou azul sólido. As características não reagirão com a peroxidase endógena, pelo que o fundo é mais limpo, especialmente adequado para tecidos com peroxidase mais endógena, tais como fígado e rim.
Passos.
1, desparafinação das secções à água (secções congeladas ou esfregaços celulares embebidos em PBS durante 3 minutos, sem reparação de antigénios)
2, bloquear a peroxidase endógena (198 ml de metanol ou água + 2 ml 30% H2O2) no quarto
temperatura durante 20 min. Lavar com água.
3, reparação de antígeno: (1) pH 7,2 tampão TBS lavado três vezes, digestão com tripsina 37 ℃, 30 min. Ou (2) de acordo com as instruções: lavagem com água destilada, colocação em solução de reparação de antigénios (Ph6.0) dentro da reparação no microondas durante 20 minutos, ou aquecimento do forno eléctrico durante 30 minutos, ou autoclave com tampa fora de gás durante 3 minutos, arrefecimento rápido; ou (3) de acordo com as instruções: sem tratamento)
4, pH 7,2 TBS tampão de lavagem três vezes.
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5, adicionar soro normal gota a gota 37 ℃, 30 minutos.
6, sacudir o excesso de soro, diluição apropriada de anticorpos específicos, 37 ℃ durante 60 minutos, ou 4 ℃ durante a noite.
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7, TBS ou PBS (pH 7,2) lavar 3 vezes.
8, anticorpo Bridge, 37°C durante 40 min ou 1 hr à temperatura ambiente.
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9, TBS ou PBS (pH 7,2) lavar 3 vezes.
10, adição gota a gota de complexo APAAP adequadamente diluído, 37°C durante 30 min.
11, Lavar 3 vezes com TBS ou PBS (pH 7,2).
12.Add, Solução de substrato AKP gota a gota, 37℃ durante 15–30 minutos, enxaguar com água após o resultado positivo parecer claro.
13.Re-staining (vermelho sólido nuclear ou hematoxilina ou verde de metilo) durante 1-2 minutos, após enxaguamento regular, gelatina glicerol selar a película.
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IV. Método LDP (polímero dextrano rotulado) (Envision two-step method)
Método de polímero marcado com enzimas, a aplicação de tecnologia de polímero marcado com enzimas, como o sistema de detecção EnVison, a utilização de peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina marcada no polímero de glucose, e depois ligada com anticorpos secundários, formando o anticorpo secundário EnVison; tal como o sistema de detecção PowerVision, a utilização de peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina marcada no fragmento de aminoácido. Uma vez que mais de 20 locais no polímero podem ligar-se ao anticorpo primário e o número de enzimas no polímero é maior, é mais sensível do que métodos como o ABC e o LSAB. Mais importante, uma vez que não há biotina presente no anticorpo secundário do sistema LDP, não há reacção cruzada com a ligação endógena à biotina, como se vê no ABC, S-P e outros métodos, reduzindo a coloração não específica e um fundo mais limpo.
Passos.
1, desparafinação da secção à água
2, solução de metanol 0,3% H2O2: bloquear a peroxidase endógena (198 ml de metanol ou água + 2 ml 30% H2O2) durante 20 min à temperatura ambiente. Lavagem com água da torneira.
3. Reparação de antigénios: (1) lavagem tampão de pH 7,2 TBS três vezes, digestão da tripsina 37 ℃, 30 min. Ou (2) de acordo com as instruções: lavagem com água destilada, colocação em solução de reparação de antigénios (Ph6.0) dentro da reparação no microondas 20 minutos, ou aquecimento do forno eléctrico 30 minutos, ou autoclave com tampa fora de gás 3 minutos, arrefecimento rápido; ou (3) de acordo com as instruções: sem tratamento)
4, pH 7,2 lavagem tampão PBS três vezes.
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5, adicionar soro normal gota a gota 37 ℃, 20 minutos.
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6, sacudir o excesso de soro, adicionar anticorpo primário, 37 ℃, 30 minutos.
7.Wash, três vezes com tampão TBS de pH 7,2.
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8.Add Envision secondary antibody dropwise, 37 ℃, 30 minutos.
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9, pH 7,2 tampão TBS lavado três vezes.
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10.DAB desenvolvimento da cor durante 3-10 minutos.
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11.Water lavagem.
12, coloração de luz hematoxilina, bluing, desidratação, transparência, selagem.
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V. Método de coloração dupla
1.Section desparafinação à água
2, Bloquear a peroxidase endógena (198 ml de metanol ou água + 2 ml 30% H2O2) à temperatura ambiente
20 min. Lavar com água.
3, Reparação de antigénios: (1) pH 7,2 tampão TBS lavado três vezes, digestão com tripsina 37 ℃, 30 min. Ou (2) de acordo com as instruções: lavagem com água destilada, colocação em solução de reparação de antigénios (Ph6.0) dentro da reparação no microondas 20 minutos, ou aquecimento do forno eléctrico 30 minutos, ou autoclave com tampa fora de gás 3 minutos, arrefecimento rápido; ou (3) de acordo com as instruções: sem tratamento)
4, pH 7,2 TBS tampão de lavagem três vezes.
5.Drop adicionar soro normal 37 ℃, 30 minutos. (pode ser usado sem)
6, sacudir o excesso de soro, adicionar o anticorpo primário 37 ℃, 30 minutos.
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7, pH 7,2 tampão TBS lavado três vezes.
8.Add, biotinylated secondary antibody dropwise, 37 ℃, 30 minutos.
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9. Lavar três vezes com tampão TBS de pH 7,2.
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10. Adicionar ABC ou complexo S-P (peroxidase de rábano silvestre) gota a gota, 37 ℃, 45 minutos.
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11. Lavar três vezes com tampão TBS de pH 7,2.
12, DAB (castanho) ou AEC (vermelho) desenvolvimento da cor durante 3~10 min.
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13, pH 7,2 tampão TBS lavado três vezes.
14.Add, gota de soro normal a 37 ℃ durante 30 minutos. (Pode ser utilizado sem)
15, sacudir o excesso de soro, adicionar o segundo anticorpo primário 37 ℃, 30 minutos.
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16, pH 7,2 tampão TBS lavado três vezes.
17, adicionar o segundo anticorpo secundário biotinylated dropwise, 37 ℃, 30 minutos.
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18. Lavar três vezes com tampão TBS de pH 7,2.
19.Add, adicionar complexo fosfatase alcalina gota a gota, 37 ℃, 30 min.
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20, Lavar três vezes com tampão TBS de pH 7,2.
21, BCIP/NBT desenvolvimento da cor (azul)
22.Water wash
23, metil verde re-mancha, desidratação, transparente, e selado.
Se escolher peroxidase de rábano pode escolher o desenvolvimento da cor DAB (castanho), no passo 21 com complexo de peroxidase de rábano, passo 23 com desenvolvimento da cor AEC (vermelho), mas é de notar que a AEC não pode ser armazenada durante muito tempo. Se escolher outro para fosfatase alcalina pode ser usado BCI/NBT, AP-Red, AP-Orange, com desenvolvimento de cor BCI/NBT é melhor.
VI. Método Imunogold (IGS)
(1) As secções são desparafinados rotineiramente em água.
(2) Digerir com solução de tripsina 0,1% em 37℃ durante 10-30 minutos.
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(3) Dupla lavagem com água destilada 2 vezes.
(4) Lavar com 0,05 mol/L TBS PH7.4 durante 10 minutos.
(5) 1% de fecho de ovalbumina durante 10 minutos.
(6) Adicionar anticorpos primários específicos gota-a-gota durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.
(7) Lavar 3 vezes com 0,5 mol/L TBS PH7.4.
(8) 1% de fecho de ovalbumina durante 10 min.
(9) Diluir o anticorpo padrão de ouro durante 45 min. a 37°C.
(9) 0,05 mol/L TBS PH7.4 por 3 vezes.
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(10) Dupla lavagem com água destilada 2 vezes.
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(11) 1% Haldol durante 10 min.
(12) Lavagem com água duplamente destilada 3 vezes.
(13) Re-coloração, selagem com glicerol e observação.
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Resultados: O local de ligação do ouro coloidal é vermelho.
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VII. Método Imunogold e prata (IGSS)
(1) As secções foram desparafinados rotineiramente em água.
(2) As secções do tecido fixadas por fixador contendo mercúrio devem ser descomercadas por álcool iodado a 0,5%, depois desiodetizadas em solução aquosa de tiossulfato a 0,5%, lavadas com água corrente, lavadas com água bidestilada, e lavadas com solução 0,05 mol/L TBS PH7.4.
(3) Digestão com solução de tripsina 0,1%, 37℃ durante 10-30 minutos.
(4) Lavar com solução 0,05 mol/L TBS PH7.4.
(5) Fechamento com 1% de ovalbumina durante 10 minutos.
(6) Titular com diluição apropriada de anticorpos específicos durante 1-2 horas a 37°C ou de um dia para o outro a 4°C.
(7) Lavar 3 vezes com solução 0,05 mol/L TBS PH7.4.
(8) 1% de fecho de ovalbumina durante 10 minutos.
(9) Titular com diluição apropriada de anticorpos marcados com ouro à temperatura ambiente durante 45 min a 37°C.
(10) Lavar 3 vezes com 0,05 mol/L TBS PH7.2.
(11) Lavar 2 vezes com água destilada e 2 vezes com água duplamente destilada.
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(12) Colocar em solução de desenvolvimento de prata durante 3-5 minutos, evitar a luz durante a reacção.
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(13) Lavar com água destilada.
(14) Lavagem com água da torneira, re-mancha de luz de hematoxilina.
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(15) Desidratação, transparência, selagem e observação.
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Resultados: O local específico de ligação de anticorpos é cinzento-preto, o fundo é cinzento claro, o núcleo é azul claro.
Preparação do reagente.
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Processador de prata.
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1, revelador de nitrato de prata.
(1) Solução aquosa de goma arábica a 10% 60ml, tampão ácido cítrico pH 3,510ml
(2) 1,7g de hidroquinona mais 30ml de água bidestilada.
(3) 40mg de nitrato de prata mais 2ml de água bidestilada.
(1) e (2) dois líquidos são completamente dissolvidos e misturados, antes da utilização adicionar (3), lugar escuro para se desenvolver.
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2. 0,05 mol/L TBS (pH 7,4).
Tris 12,1g,
NaCl 17.5g,
>br />Agite bem para dissolver, ajuste o pH a 7,4 com HCl concentrado, depois adicione água duplamente destilada a 2000ml.
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