Expressão e significado clínico do TLR9 no cancro pancreático
WU Hanqing ZHU Shi-kai ZHANG Jian-jun YANG Zhi-yong WANG Chun-you WU Heshui*
[Resumo] Objectivo Detectar a expressão do TLR9 nos tecidos do cancro pancreático e explorar o seu significado clínico. Métodos PCR quantitativa em tempo real, immunoblotting e imuno-histoquímica foram utilizados para detectar a expressão de TLR9 em 30 tecidos cancerosos pancreáticos e os seus tecidos paraneoplásicos adjacentes e 10 tecidos pancreáticos normais, e para analisar a relação entre a expressão de TLR9 em tecidos cancerosos pancreáticos e a graduação patológica, fase clínica e metástase. Resultados O valor da dobra de amplificação TLR9 mRNA foi 2,32 (1. 41-3,22) em tecidos de cancro pancreático e 1,23 (1,18-1,28) em tecidos paraneoplásicos, com diferenças significativas na expressão entre os dois grupos (t=2,642, P=0,023). A taxa de expressão positiva da proteína TLR9 no cancro pancreático foi de 73,3%, 33,3% nos tecidos paracancerosos e 20% nos tecidos pancreáticos normais, mostrando uma tendência decrescente (c2 =13,99, P=0,001). A elevada expressão de TLR9 no cancro pancreático foi positivamente correlacionada com a diferenciação do tumor, estágio de TNM e metástase dos gânglios linfáticos. Conclusão O TLR9 foi altamente expresso em tecidos de cancro pancreático, e a expressão do TLR9 foi associada ao grau de tumor, sugerindo que pode estar envolvido no desenvolvimento do cancro pancreático através de mecanismos imunitários. Wu Hanqing, Departamento de Medicina de Emergência, Hospital da Faculdade de Medicina de Wuhan Union
Keywords】pancreatic tumor, cancro, TLR9
A expressão TLR9 no cancro pancreático e o seu significado clínico
Han-Qing Wu, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Zhi-Yong Yang, Chun-You Wang, He-Shui Wu
Departamento do Centro de Cirurgia Pancreática ,Union Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan Hubei 430022,China
Correspondência para: Professor He-Shui Wu, Email:[email protected].
[Objectivo: Detectar a expressão do receptor de Toll-like 9 (TLR9) no cancro pancreático e explorar o seu significado clínico. Métodos: A técnica RT-PCR em tempo real, método western blot e método imunohistoquímico foram utilizados para examinar a expressão de TLR9 no cancro pancreático, tecidos próximos do tumor e tecidos pancreáticos normais que foram obtidos durante a operação de 30 pacientes com carcinoma pancreático e 10 pacientes normais sem tumor. As relações com grau patológico, fase clínica e metástase do cancro pancreático foram analisadas estatisticamente. Resultados O nível do valor de amplificação da expressão de TLR9mRNA nos tecidos pancreáticos humanos, tecidos paracancerosos foi 2.32（1.41~3.22）and 1.23（1.18~1.28），respectively（t=2.642,p=0.023）.The altamente expresso TLR9 correlacionado significativamente com o grau de diferenciação tumoral, um [Palavras-chave] Neoplasias pancreáticas; cancro; receptor de portagens 9 Os receptores de tolerância (TLR) são uma antiga família de receptores recentemente descoberta que não só são importantes para a imunidade natural, mas também estão estreitamente associados à imunidade específica, tolerância imunitária e prevenção e tratamento de certas doenças. O TLR9 altamente expresso estava a diminuir gradualmente (c2=13,99,P=0,001), e verificou-se que o receptor TLR9 altamente expresso estava envolvido no desenvolvimento de vários tumores malignos [1]. TLR9 é um membro importante desta família e é capaz de estimular a expressão de um grande número de citocinas e quimiocinas como a interleucina (IL)-12, IL-6, interferon-γ, proteína inibidora de monócitos e proteases metalloplásmicas por células B e células dendríticas[2]. O altamente expresso TLR9 foi encontrado em muitos tumores, mas não é claro se o TLR9 está associado ao desenvolvimento do cancro pancreático. O objectivo deste estudo era investigar a relação entre a expressão TLR9 no cancro pancreático e o desenvolvimento do cancro pancreático, e explorar o seu significado clínico a fim de fornecer uma nova base para o tratamento do cancro pancreático. Dados e métodos I. Dados clinico-opatológicos Trinta tecidos humanos frescos de cancro do pâncreas e tecidos paracancerosos correspondentes (1-2 cm de acordo com a margem do tumor) foram obtidos de doentes com cancro do pâncreas, e 10 amostras de tecido pancreático normal foram obtidas de doentes sem tumor que necessitaram de pancreatectomia parcial por outras razões. A patologia pós-operatória confirmou que nenhuma radioterapia ou quimioterapia pré-operatória tinha sido administrada. Os espécimes foram recolhidos imediatamente após a ressecção cirúrgica, em duplicado, um imediatamente em azoto líquido, e depois armazenados a -80°C. O outro foi fixado em formaldeído a 10% e incorporado em parafina para análise imunohistoquímica. 19 dos 40 pacientes eram do sexo masculino e 11 do sexo feminino, com 39-75 anos de idade, com uma idade média de 57 anos. A classificação histopatológica dos tumores: 12 casos de tumores altamente diferenciados e 18 casos de tumores moderadamente mal diferenciados. 10 casos de metástase de gânglios linfáticos e 20 casos de não metástase. II. PCR quantitativa em tempo real para expressão do gene TLR9 O RNA tecido total foi extraído de acordo com as instruções do kit Trizol (sigma), e a pureza e concentração do RNA foram determinadas pelo espectrofotómetro UV. cDNA foi então sintetizado por transcrição reversa usando ReverTra Ace (Toyobo). os iniciadores foram concebidos de acordo com a sequência TLR9 mRNA humano GenBank, com a sequência de iniciadores TLR9 a montante de: 5′- GCCCAAATCCCTCATCCC-3′, a jusante: 5′-AACAGTTGCCGTCCATGAATAG-3′, produto de amplificação 113bp. primários para a referência interna β-actin, a montante: 5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′, a jusante: 5′- TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′, produto de amplificação de 190bp (Shanghai Biotechnology Service Co.) A PCR quantitativa em tempo real (SYBR GREEN) foi utilizada para detectar o TLR9mRNA. procedimento de reacção da curva de amplificação: 50°C para 2min, 95°C para 2min, depois desnaturação a 95°C para 15s, recozimento para 15s e extensão a 72°C para 45s para um total de 40 ciclos. O ΔCT=CT(target gene)-Ct(β-actin) para o cancro pancreático ou os tecidos paracancerosos correspondentes e ΔCT=ΔCT experiment-ΔCT controlo para 10 tecidos pancreáticos normais, e utilizámos o valor médio de ΔCT para 10 tecidos pancreáticos normais como controlo. O ploidy de amplificação = 2-ΔΔCT foi obtido por cálculo. III. Imunoblotting para detectar a expressão da proteína TLR9 A extracção de proteína tecidular foi realizada por métodos convencionais e a concentração de proteínas foi medida pelo método de Komas Brilliant Blue. 15 μl de proteína foi tomado para 10% de electroforese em gel de poliacrilamida, electrotransferido para uma membrana de nitrocelulose, 5% de leite em pó desnatado foi utilizado para selar o antigénio não específico, foi adicionado anticorpo monoclonal de coelho anti-humano TLR9 (empresa de sinalização celular) diluído 1:750, incubado durante a noite a 4°C, a membrana foi lavada com TBST contendo 0,1% de Tween 20, foi adicionado peroxidase de rábano silvestre (HRP) O anticorpo secundário anti-coelho de cabra foi incubado à temperatura ambiente durante 2 h. Após lavagem da membrana, o substrato de quimioluminescência reforçada EcL Plus reagente foi adicionado e exposto a x película durante 30 s. A película foi rotineiramente desenvolvida e fixada. As imagens foram digitalizadas e analisadas utilizando um software de análise automática de imagens de electroforese em gel (Band scan v5.0). IV. Detecção imuno-histoquímica da expressão da proteína TLR9 pelo método de imuno-histoquímica SP (estreptavidina-erosidase), remetendo para as instruções do kit de imuno-histoquímica (Wuhan PhD Co., Ltd.). Foram utilizadas secções do conhecido tecido TLR9 positivo do cancro do pulmão [3] como controlo positivo e PBS em vez de anticorpos primários foi utilizado como controlo negativo. Ao microscópio, as células coradas de amarelo acastanhado foram consideradas positivas, e o material de coloração era granular ou escamoso, principalmente presente no citoplasma das células tumorais. Os resultados da coloração foram avaliados por dupla ocultação, observando aleatoriamente 10 campos de alta ampliação, evitando margens tumorais e áreas necróticas. A análise semi-quantitativa foi realizada de acordo com a intensidade do desenvolvimento da cor e a percentagem de coloração, e as células foram classificadas de acordo com o grau de coloração positiva: 0 para negativo, 1 para fracamente positivo, 2 para moderadamente positivo e 3 para fortemente positivo. A percentagem de coloração positiva foi dividida em: 0 para nenhuma coloração, 1 para células positivas totais <25%, 2 para células positivas entre 25% e 49%, e 3 para células positivas totais acima de 50%. As duas pontuações foram somadas, sendo 0-1 negativo (C), 2-3 fracamente positivo (), 4-5 positivo () e 5 ou mais fortemente positivo (). () com () para alta expressão e (C) com () para baixa expressão. V. Métodos estatísticos O software de análise estatística SPSS 13.0 foi utilizado para aplicar o teste t, χ2 teste, método de probabilidade exacta de Fisher e teste de soma de classificação para análise de diferenças e correlações entre valores. com α=0. 05 como nível de teste e P<0,05 como diferença estatisticamente significativa. Resultados 1 Resultados de PCR quantitativa em tempo real TLR9 mRNA e β-actin mRNA foram expressos em tecido pancreático normal, tecido canceroso pancreático e tecido paracanceroso pancreático. O TLR9 mRNA em tecidos pancreáticos normais foi utilizado como controlo. O valor da dobra de amplificação do TLR9 mRNA no cancro pancreático foi de 2,32 (1,41~3,22) e nos tecidos paraneoplásicos foi de 1,23 (1,18~1,28), e a diferença de expressão entre os dois grupos foi significativa (t=2,642, p=0,023). 2 Resultados de Immunoblotting Como visto na Figura 1, a expressão da proteína de referência interna GAPDH foi observada nos tecidos cancerígenos e paracanceres, bem como nos tecidos pancreáticos normais, com bandas proteicas a 36 kDa e TLR-9 a 130 kDa. A expressão de TLR9 nos tecidos cancerígenos foi significativamente mais elevada do que nos tecidos paracanceres e pancreáticos normais correspondentes. Figura 1 Resultados da immunoblotting de proteínas TLR-9 (1: pâncreas normal, 2: tecido paracanceroso pancreático, 3 tecido canceroso pancreático) 3 Resultados imuno-histoquímicos A proteína TLR9 era principalmente expressa no citoplasma das células cancerosas, que era de cor bronzeada ou castanha e corada uniformemente; a expressão da proteína TLR9 também podia ser vista no citoplasma dos tecidos paracancerosos e pancreáticos normais, mas era amarelo claro e menos frequente do que nos tecidos pancreáticos cancerosos (Figura 2). 10/30) e 73,3% (22/30), com diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (χ2=13,99, P=0,001) (Quadro 1). Não foi observada uma expressão elevada de TLR9 nos tecidos pancreáticos normais, enquanto 73,3% (22/30) dos tecidos cancerosos do pâncreas mostraram uma expressão elevada da proteína TLR9. A taxa de expressão positiva de TLR9 mostrou uma tendência crescente dos tecidos normais, tecidos paraneoplásicos para tecidos de cancro pancreático. a alta expressão da proteína TLR9 em 30 tecidos de cancro pancreático não estava relacionada com a localização e tamanho do tumor (P>0,05), mas sim com o grau de diferenciação tumoral, estágio de TNM e metástase linfonodal (P<0,05, Tabela 2). Figura 2 Expressão da proteína TLR9 nos tecidos cancerosos pancreáticos, tecidos pancreáticos paracancerosos e tecidos pancreáticos normais (×200); tecidos pancreáticos cancerosos (A), tecidos pancreáticos paracancerosos (B), tecidos pancreáticos normais (C) Quadro 1 Expressão da proteína TLR9 em tecidos normais, paraneoplásicos e pancreáticos cancerígenos grupo Exemplo TLR9 proteína positiva Taxa de positividade (%) Positivo negativo tecidos normais tecidos paraneoplásicos tecidos para o cancro do pâncreas 10 30 30 2 20 22 8
10 8 20.0 33.3 73.3 Quadro 2 Relação entre a expressão elevada de TLR9 nos tecidos do cancro pancreático e parâmetros patológicos Características clínicas Número de casos Positivo para alta expressão de TLR9 Negativo para expressão elevada de TLR9 Taxa de positividade (%) Valor P sítio do tumor cabeça do pâncreas cauda do corpo pancreático 20 10 15 7 5 3 75.0% 70.0% 1.00 Tamanho do tumor ≤3cm >3cm 17 13 13 9 4 4 76.5% 69,2% de 0.68 diferenciação altamente diferenciada hypofractionated 12 18 6 16 6 2 50.0% 88.9% 0.034 Fase TNM І CП Ш- 13 16 7 15 6 1 53.8% 93.8% 0.026 Metástase de gânglios linfáticos não Havia 20 10 13 9 7 1 65.0% 90.0% 0.024 Nota: χ2 teste, o método de probabilidade exacta de Fisher foi aplicado para análise estatística Discussão Os TLRs são receptores de reconhecimento de padrões patogénicos recentemente identificados que reconhecem componentes moleculares conservados de tipos específicos de microrganismos, ou seja, padrões moleculares associados aos patogénios (PAMPs). em 1997, Medzhitov [4] et al. identificaram pela primeira vez o primeiro Toll humano variantes homólogas (isto é, TLR4), e mais tarde foram identificadas e confirmadas 10 proteínas da família TLR humanas, denominadas TLR1-TLR11. Entre elas, TLR9 é um membro importante da família TLR, cujos PAMPS especificamente reconhecidos são motivos CpG em DNA bacteriano e viral ou oligodeoxinucleotídeos sintéticos (CpG- oligodeoxinucleotídeos, CpG-ODN) [5], TLR9 tem um significado biológico importante na mediação da activação da imunidade inata por ADN CpG exógeno. para além dos seus efeitos anti-infecciosos, TLR9 está também associado a perturbações auto-imunes e tumores malignos [6]. Tem sido sugerido que as vias de sinalização induzidas pelos TLR, incluindo TLR9, podem desempenhar um papel importante na formação de tumores, e que a upregulação da expressão dos TLR pode estar intimamente relacionada com a ocorrência e desenvolvimento de cancros gástricos, intestinais e pulmonares [7].
O estudo também descobriu que a expressão TLR9 sobre tumores poderia proporcionar novas abordagens à quimioterapia e imunoterapia de tumores.
Contudo, pouco se sabe sobre a expressão e o papel do TLR9 no cancro pancreático. Neste estudo, o TLR9 foi detectado em tecidos tumorais de cancro do pâncreas a nível genético e proteico, bem como o tamanho da proteína TLR9, e comparado com tecidos pancreáticos paracancerosos e tecidos pancreáticos normais, e os resultados a nível genético revelaram que o TLR9 mRNA foi expresso em tecidos cancerosos pancreáticos, tecidos pancreáticos paracancerosos e tecidos normais, mas a expressão mais elevada foi encontrada em tecidos cancerosos, que foi significativamente mais elevada do que a dos tecidos não cancerosos (P<0.05 ). Nas imagens de coloração imunohistoquímica, verificou-se que o TLR9 foi predominantemente expresso nas células citoplasmáticas do adenocarcinoma pancreático e a taxa de expressão positiva do TLR9 foi significativamente mais elevada nos tecidos do adenocarcinoma pancreático do que nos tecidos paracancerosos e pancreáticos normais, o que é consistente com os resultados de correlação positiva do estudo de Droemann [3] no cancro do pulmão. A elevada expressão de TLR9 nos tecidos do cancro pancreático não estava relacionada com a idade, sexo, localização e tamanho do tumor, mas sim com o grau de diferenciação do tumor, estágio TMN, metástase linfonodal ou metástase distante, sugerindo que os receptores TLR9 não estão apenas envolvidos em funções fisiológicas como o crescimento e desenvolvimento de tecido pancreático normal, mas também no processo de transformação maligna do tecido pancreático. estudos de Schmausser [8] et al. confirmaram o significado de O TLR9, juntamente com outros TLR, está envolvido na carcinogénese gástrica Os resultados do presente estudo são consistentes com isto. Nos últimos anos, um grande número de estudos confirmou que a ODN CpG tem um forte efeito imunitário apoptótico na direcção Th1, principalmente através da ligação a TLR9 e da indução da secreção de citocinas de polaridade Th1 tais como IFN-7 e IL-12 para promover a diferenciação das células Th0 em direcção a Th1. Por exemplo, o ADN CpG entra nas células dendríticas através da endocitose não dependente do receptor, interage especificamente com o TLR9 na região lisossómica, e depois activa as vias de sinalização a jusante via IRAK1, IRF7, TRAF6, MAPK, as vias de factor-KB nuclear (NF-KB) e o articulador MyD88 [9]. Este estudo examinou o TLR9 nos tecidos do cancro pancreático aos níveis do gene e da proteína, bem como o tamanho da proteína TLR9. Estas células maduras que apresentam antigénio expressam moléculas co-estimuladoras (CD80, CD86), receptor de quimiocina CCR7, secretam citocinas do tipo Th1, e activam células NK [10], o que faz com que mais células plasmáticas semelhantes e dendríticas amadureçam e apresentem antigénio devido ao aumento da expressão dos receptores Fc na superfície dos neutrófilos e ao aumento da actividade citotóxica. Através da acção de CpG e TLR9, as células que apresentam antigénio, tais como as células Dc, podem cruzar antígenos exógenos, activando assim a activação cruzada de células CD8+ T, células NK, macrófagos, gerando uma resposta imunitária do tipo Th1 e activando a resposta imunitária natural [11]. E actualmente o CpG ODN é utilizado como um adjuvante imunitário para induzir uma forte resposta imunitária do tipo Thl via TLR-9 em células adenocarcinoma pulmonar humano A549, que pode ser aplicado como monoterapia ou terapia adjuvante à imunoterapia no tratamento de tumores [12]. A elevada expressão de TLR9 nos tecidos do cancro pancreático sugere que pode ser um novo alvo para a terapia tumoral. a expressão da proteína TLR9 correlaciona-se com a malignidade das células cancerosas pancreáticas e com a presença de metástases nos gânglios linfáticos, o que fornece uma referência para o tratamento e prognóstico do cancro pancreático. A imunoterapia do cancro do pâncreas utilizando o ligante TLR9 relacionado com o CpG ODN pode oferecer novas possibilidades terapêuticas para o tratamento do cancro do pâncreas. Ref. 1. Jurk M, Vollmer J. Therapeutic Applications of Synthetic CpG Oligodeoxinucleotides as TLR9 Agonists for Immune Modulation[J]. BioDrugs,2007;21(6):387-401. 2. Theiner G, Rossner S, Dalpke A, et al. TLR9 coopera com TLR4 para aumentar a libertação de IL-12 por células dendríticas murinas[J]. Molecular Immunology,2008;45(1):244-252. 3. Droemann D, Albrecht D, Gerdes J ,et al. Células de cancro do pulmão humano expressas funcionalmente activas Receptor tipo Toll-like 9[J]. Respir Res,2005,6(1):1-10. 4. Medzhitov R, Preston - Hurlburt P, Janeway CA. Um homólogo humano da proteína Drosophila Toll sinaliza a activação da imunidade adaptativa[J].
Natureza, 1997, 388: 394C397. 5. Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, et al. Um receptor tipo Toll-like reconhece o ADN bacteriano[J]. Nature,2000, 408(6813):740. 6. Ishii KJ, Akira S. Reconhecimento imunológico inato do ADN[J], e regulação pelo ADN[J]. Trends Immunol, 2006 Nov;27:525-532. 7. Coussens LM , Werb Z. Inflamação e cancro[J] . Natureza , 2002; 420 (6917): 860-867. 8. Schmauber B, Andrulis M, Endrich Med Microbio, 2005,295(3):179-185. 9. portagem – como os receptores : rede para o sucesso[J]. Eur J Immunol , 2003 ,33 (7) :1767. 10. Ballas Z. Modulação da actividade celular NK por oligodeoxinucleotídeos CpG[J]. Immunol Res,2007;39(1-3):15-21. Krieg AM. Potencial terapêutico de activação do receptor 9 tipo Toll-like [J]. Nat rev drug disc, 2006, 5:471-484. 12. Krieg AM. Receptor de portagens tipo 9 (TLR9) agonistas no tratamento do cancro[J]. Oncogene, 2008; 27:161-167. Este artigo foi publicado no Chinese Journal of Pancreatic Diseases, Vol. 3, 2011. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Subvenção nº 30200272) Biografia do autor: Wu HQ, M, PhD, principalmente em tumores pancreáticos. E-mail:[email protected] A correspondência deve ser endereçada a Wu Heshui, Professor, PhD Supervisor, Center for Pancreatic Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China; Email:[email protected].