O cancro colorrectal é um dos cancros mais prevalentes no Reino Unido, com 40.000 novos diagnósticos por ano, uma taxa de sobrevivência de 55% em 5 anos, dados de estadiamento de pré-tratamento disponíveis para apenas 23% dos pacientes que se submetem a metástases, e 15% dos pacientes que se submetem a cirurgia mas ainda desenvolvem metástases recorrentes.
Um desenvolvimento importante no tratamento do cancro colorrectal tem sido o aparecimento de anticorpos monoclonais que visam o EGFR. Os tratamentos com anticorpos monoclonais incluem o cetuximab, bevacizumab e panitumumab. Os dados disponíveis mostram claramente que a terapia anti-EGFR é ineficaz no cancro colorrectal mutante KRAS.
Os dados iniciais, limitados aos códões KRAS 12 e 13, foram capazes de prever se o tratamento com cetuximab seria ineficaz, e a NICE recomenda os resultados deste estudo para utilização na prática. O cetuximab só deve ser utilizado em cancro colorrectal hepático metastático e os testes para o códão KRAS 12 e 13 mutações devem ser realizados ao determinar a aptidão de um doente para este tratamento.
Os testes KRAS tornaram-se rotina para ajudar a estratificar os doentes para a terapia anti-EGFR. Outras organizações fora do Reino Unido também recomendam o teste do gene KRAS para o tratamento do cancro colo-rectal.
O artigo do Dr Wong na revista JCP, que se destina a orientar a prática clínica no Reino Unido, também cobre os testes NRAS no cancro colorrectal e analisa as técnicas e a investigação que influenciaram os testes RAS no cancro colorrectal, com particular ênfase nas implicações práticas dos testes. A ordem do artigo segue os procedimentos para testar os espécimes RAS.
Selecção de casos
Testes de rotina ou a pedido
Se os testes RAS para cancro colorrectal devem ser de rotina ou a pedido continua a ser controverso. O modelo de teste de rotina significa que todos os espécimes ressecados cirurgicamente são rotineiramente testados geneticamente e os resultados descritos no relatório de patologia. Se em algum momento no futuro um paciente necessitar de terapia anti-EGFR, estes dados moleculares estarão imediatamente disponíveis.
Os testes de rotina são uma boa solução para os longos tempos de teste do gene KRAS. Os longos tempos de teste não são causados pelo método de análise, mas sim pelo tempo gasto no rastreio do tecido adequado. Os testes de rotina também previnem a perda de blocos de tecido, danos em blocos de tecido que tenham sido indevidamente armazenados, ou a incapacidade de realizar testes RAS devido à utilização em outros testes.
A desvantagem dos testes de rotina é que não é necessário para os doentes que nunca desenvolverão metástases. A forma de reduzir testes desnecessários é identificar espécimes de cancro colorrectal com factores de alto risco de metástase, tais como a presença de invasão vascular, metástases linfonodais ou estadiamento patológico T4.
A maior desvantagem dos testes de rotina é que os novos dados sugerem que o RAS é mais do que apenas códão KRAS 12 e 13 mutações. Se um doente tiver de ser tratado com terapia anti-EGFR e tiver sido previamente testado para os códões KRAS 12 e 13, o doente será agora também testado para mutações NRAS e mutações KRAS adicionais.
Estudos recentes mostraram que mais genes estão associados à resistência à terapia anti-EGFR, e que estão a surgir novas terapias orientadas. Os testes a pedido só são realizados quando um caso foi discutido por uma equipa multidisciplinar e foi tomada a decisão de receber o tratamento relevante. Na altura da redacção do presente relatório, os testes RAS a doentes com cancro colorrectal metastásico realizados por laboratórios no Reino Unido estão apenas cobertos por seguros, o que significa que os testes a pedido são agora prática corrente no Reino Unido.
A fim de melhorar a disponibilidade dos testes RAS no Reino Unido, é importante racionalizar a distribuição dos recursos disponíveis, desenvolver um sistema de testes mais racional, melhorar o acesso ao tecido colorrectal cancerígeno e assegurar a entrega atempada de amostras para testes a pedido.
Tecido primário ou metastásico
Muitos estudos têm examinado se as mutações KRAS são consistentes em tecido colorrectal primário ou metastático do cancro. Uma meta-análise mostrou uma concordância muito elevada de 94,1%. Contudo, existem alguns dados que sugerem que esta concordância está relacionada com a localização anatómica, sendo as metástases pulmonares e linfonodais menos concordantes com o local primário. A meta-análise acima referida também mostrou uma concordância de 81,3% entre as metástases linfonodais e o cancro colorrectal primário.
Devido à falta de concordância genética absoluta entre focos primários e metastáticos, é preferível testar tecido colorrectal canceroso metastático se este estiver disponível e puder ser entregue ao laboratório de testes o mais rapidamente possível. Se o tecido metastático não estiver prontamente disponível, deve ser enviado tecido do local primário, uma vez que não há provas suficientes até à data de que o tecido metastático seja mais específico para testes genéticos RAS.
Tipo de espécimen
As amostras histopatológicas ou citológicas podem ser utilizadas para testes RAS, incluindo secções utilizando a coloração HE ou a coloração imuno-histoquímica. Algumas amostras, tais como amostras endoscópicas ou biópsias com agulha grossa, têm amostras limitadas devido a técnicas de aquisição de amostras, e no caso de amostras de excisão estão disponíveis múltiplas amostras de tumores, mas normalmente apenas uma amostra representativa de tecido é seleccionada para exame. O número limitado de espécimes levanta uma série de pontos a considerar.
Biopsia de espécimes contendo apenas adenomas
A primeira é se o paciente tiver provas clínicas e imagiológicas claras de cancro colorrectal, mas a amostra da biópsia endoscópica é apenas adenómica e é a única amostra disponível para testes RAS. O que deve ser feito neste momento? Alguns acreditam que a amostra do adenoma não deve ser testada e que o sítio primário ou metastático deve ser re-biopsiado; outros acreditam que o adenoma deve ser testado e reportado se uma mutação for identificada, mas se não houver mutação, isto não prova que o tumor não sofreu mutação e que ainda é necessária uma re-biopsiada.
A segunda abordagem baseia-se no facto de que as mutações RAS ocorrem geralmente nas fases iniciais da formação de tumores e são mutações-chave, e que demonstrar a presença de mutações RAS em adenomas sugere que os cancros colorrectais que se desenvolvem a partir de adenomas também podem ter a mutação. Contudo, as mutações RAS podem também ser um evento tardio na carcinogénese colorrectal, o que significa que os adenomas podem ser do tipo selvagem RAS e os adenocarcinomas podem ser do tipo mutante RAS.
A terceira abordagem é semelhante à segunda, testando os adenomas com hiperplasia heterogénea de alto grau, um estado mais próximo do cancro.
Heterogeneidade das mutações dentro do tumor
Outra questão é qual escolher se há múltiplos espécimes ressecados à escolha? Este tópico relaciona-se com a heterogeneidade mutacional tumoral, ou seja, o fenótipo genético de diferentes clones no mesmo cancro colorrectal pode ser inconsistente. As amostras endoscópicas são geralmente limitadas e superficiais e podem não ser detectadas se o clone mutante estiver localizado nas profundezas do tumor, ou podem não ser detectadas se forem amostras ressecadas onde o clone mutante só está presente dentro de uma massa de tecido específica.
Com base nos últimos dados KRAS e NRAS, a presença de qualquer mutação RAS é geralmente considerada suficiente para prever a resistência à terapia anti-EGFR. A coexistência de mais do que uma mutação RAS no mesmo cancro colorrectal não tem mais significado clínico.
Mais clinicamente significativa é a presença tanto de clones mutantes do tipo RAS como de clones selvagens no mesmo tumor, especialmente se a proporção de clones mutantes for baixa. Este último refere-se a um baixo nível de mutação, possivelmente porque apenas uma pequena proporção de genes RAS mutantes está presente em extractos de ADN de cancro colorrectal, que precisa de ser distinguida de um baixo nível de células tumorais malignas na massa tecidual, levando à diluição de genes mutantes no ADN de células tumorais não malignas.
Alguns dados sugerem que também existem variações do genótipo KRAS dentro do mesmo tecido colorrectal cancerígeno. Uma pequena proporção de cancros colorrectais é uma mistura de clones do tipo selvagem e KRAS exon 2 e 3 mutantes, e esta variação genotípica é pequena: em 10/13 espécimes, um determinado clone mutante KRAS excede 80% do tumor.
Um estudo recente examinou mutações KRAS em 30 espécimes emparelhados endoscópicos e ressecados utilizando a análise da curva de lise de alta resolução e descobriu que os genótipos eram idênticos em cada par.
Foi utilizado um método mais sensível para rever se os cancros colorrectais do tipo selvagem têm níveis mais baixos de mutações KRAS e se este nível de mutação tem impacto na terapia anti-EGFR. 7-20% dos cancros colorrectais do tipo selvagem identificados por sequenciação Sanger ou PCR em tempo real foram encontrados com mutações nos códões KRAS 12 e 13 quando reexaminados por sequenciação de pirofosfato, kit de verificação Therascreen, PCR com ácido nucleico alvo ou PCR de amplificação de mutação. A eficácia da terapia anti-EGFR para o cancro colorrectal a este nível de mutação do KRAS ainda precisa de ser investigada.
Pode haver avanços particulares no estudo da heterogeneidade mutacional intra-tumoral com o advento de testes mais sensíveis, e o trabalho clínico pode agora prosseguir de acordo com as directrizes. Se tanto amostras ressecadas como biópsias estiverem disponíveis, devem ser preferidos blocos de tecido para testes; se apenas estiver disponível tecido de biópsias e o resultado for um genótipo de tipo selvagem, não há agora provas suficientes para apoiar uma biópsia repetida para excluir mutações de baixo nível.
Os testes de mutação não só influenciam a escolha do tratamento, mas mais importante ainda, a presença de mutações de baixo nível pode ser um preditor de resistência futura à terapia anti-EGFR. Assume-se frequentemente que estes clones mutantes começam em números baixos, mas que a terapia anti-EGFR leva os clones mutantes a crescerem em excesso e a manifestarem-se como resistência à terapia quando estão presentes números suficientes.
Factores influenciadores na preparação
Foi publicada uma revisão detalhando os factores na preparação de amostras de tecido que podem influenciar os resultados dos testes moleculares subsequentes, e os seguintes são particularmente relevantes para os testes RAS no cancro colorrectal.
A maioria do tecido colorrectal cancerígeno utilizado para testes de mutação RAS provém de biópsias fixadas em formol ou de tumores primários ressecados cirurgicamente. A fixação destes últimos espécimes é frequentemente atrasada ou mal fixada, principalmente porque o intestino grosso não é completamente dissecado ou enxaguado, ou apenas são colhidos espécimes parcialmente fixados.
Atraso ou má fixação resulta na degradação do ADN através de apoptose ou necrose, e a imersão prolongada em formalina também degrada o ADN através de uma ligação cruzada excessiva, reduzindo a sensibilidade da detecção de mutações e aumentando as hipóteses de falha. A fixação de formalina também pode causar a desamidação da citosina, levando à detecção de mutações antropogénicas.
O fixador Bouin já não é comummente utilizado no Reino Unido, e os blocos anteriores de tecido podem ser fixados por Bouin. É necessário ter cuidado quando o tecido no bloco fica completamente amarelo ou quando o tecido contém eluato do processo de extracção de ADN. O tecido fixado com Bouin tem uma maior probabilidade de falha nos testes moleculares, em parte devido ao tempo de armazenamento do tecido, mas também porque alguns componentes do fixador Bouin podem acelerar a degradação do ácido nucleico.
Em alguns hospitais é habitual ancorar a amostra a uma tira de acetato antes de fixar a amostra da biopsia endoscópica, o que pode resultar em rendimentos de ADN ainda mais baixos se a tira de acetato não for removida. O registo do conteúdo de células tumorais é apropriado para a análise molecular. Não há diferença técnica entre tecido a ser seccionado ou cortado directamente para extracção de ADN, uma vez que o tecido deve ser extraído o mais cedo possível após a excisão para reduzir a oxidação do ADN.
Conteúdo celular maligno
Quando o tecido somático mutante contém tanto células malignas como não malignas, é fundamental quantificar com precisão o conteúdo de células malignas. A proporção de ADN de células tumorais malignas no extracto final de ADN é um bom indicador da proporção de ácidos nucleicos malignos na histopatologia de todos os ácidos nucleicos e é preferível a medir a proporção de área ocupada por tumores.
Isto é particularmente importante no cancro colorrectal, onde as áreas necróticas e sem células não devem ser contadas e devem ser removidas sempre que possível. Os cromossomas aneuploidia são comuns em tumores e podem potencialmente aumentar ou diminuir a sensibilidade de detecção. Este documento recomenda que o número mínimo de células tumorais utilizadas para detectar uma mutação seja duas vezes o número mínimo de células tumorais testadas.
Por exemplo, se um método requer um mínimo de 5% de células tumorais, um mínimo de 10% de células malignas no tecido seria apropriado para testes de mutação. Há variabilidade na avaliação do conteúdo de células tumorais no cancro colorrectal pelo que o laboratório gostaria de utilizar um conteúdo mínimo seguro de células tumorais para a análise, mas esta proporção precisa de ser mais validada.