A metilação e a desmetilação do ADN são na realidade algumas ondas num afluente do longo rio da epigenética, que está agora em pleno andamento. A metilação do ADN é uma das primeiras modificações epigenéticas a ser descoberta e reconhecida, e envolve a adição de um grupo metilo (-CH3) ao 5º átomo de carbono do anel de pirimidina do anel de base da ctidina (C). Esta modificação não ocorre em todos os Cs da sequência de ADN, mas principalmente em Cs que ocorrem juntamente com CGs (foi mais tarde descoberta: nas células estaminais embrionárias, ocorre muita metilação também noutros Cs). Não olhe para esta pequena modificação, mas acrescenta informação extra ao ADN, permitindo que uma rica diversidade de informação genética seja expressa num genoma limitado. A questão que se coloca, qual é exactamente esta informação extra? Para começar, a metilação do ADN é simplesmente entendida como uma “fechadura”, onde as partes do ADN marcadas pela metilação do ADN são, na sua maioria, genes que precisam de ser “apagados” e “aprisionados”, por exemplo Os “malfeitores” do genoma, transposões, são controlados pelo “cadeado” da metilação, e se não forem controlados ou forem mal controlados, estes “malfeitores” saltarão à volta do genoma. Se não forem controlados ou não regulamentados, estes “malfeitores” podem saltar no genoma, estragando-o e causando muitos problemas, tais como o desenvolvimento de tumores. A metilação do ADN é mais consistente com a definição de herança epigenética; é muito estável e hereditária a nível somático, o que significa que as células “filhas” formadas pela divisão das células somáticas não só herdam a sequência genómica de ADN das células “progenitoras”, mas também Isto significa que a célula ‘filha’ não só herda a sequência de ADN genómico da célula ‘mãe’, mas também copia muito fielmente o padrão de metilação do ADN genómico da célula ‘mãe’. Contudo, durante a formação de células germinativas, e também durante a diferenciação do óvulo fertilizado no embrião, a metilação do ADN genómico sofre uma “remodelação” maciça com uma janela de tempo muito curta. Por exemplo, a metilação genómica do ADN do esperma é aparentemente “limpa” antes do óvulo fertilizado se dividir, e começa a ser reconstruída rapidamente logo após a divisão do óvulo fertilizado. Há também remodelação por metilação durante a formação de células germinativas (esperma e óvulos). Isto levanta uma importante questão fundamental: como é que a metilação do ADN é “limpa” em tão pouco tempo? A chave para responder a esta pergunta é encontrar uma demetilase de ADN que possa remover os grupos metilados do ADN. Contudo, o problema era fácil de colocar, mas não fácil de resolver. Levou a muitas pessoas mais de uma década de trabalho desde que foi proposto pela primeira vez, mas continua por resolver! A razão para isto é que o processo de desmetilação do ADN é limitado ao período pós-fertilação antes da divisão dos ovos e produção de células germinativas, com uma janela de tempo muito curta e fontes de células limitadas para obter um número suficiente de células ou tecidos para manipulações de biologia molecular para identificar genes, e ainda menos para manipulações bioquímicas para purificar a enzima, tornando o estudo extremamente difícil. Este processo de desmetilação do ADN tem sido um grande mistério durante muitos anos. A questão é importante, mas “o cão morde o ouriço e não há maneira de chegar a ele”. Há um interlúdio. Um biólogo canadiano de origem judaica, o Professor Szyf, fez uma grande piada sobre a metilação do ADN, mas saiu dos trilhos e acabou como um cientista alternativo, uma figura marginal no terreno. O seu laboratório descobriu uma enzima de desmetilação de ADN, que foi publicada na Nature em 1999 e causou uma sensação na comunidade, mas outros laboratórios não conseguiram replicá-la. O estudo da desmetilação do ADN permaneceu adormecido durante vários anos. Em 2005, a descoberta das demetilases histónicas e do mecanismo catalítico no laboratório de Shi Yang causou uma sensação e inspirou as pessoas a procurar e identificar as demetilases de ADN. O laboratório de Shang Yongfeng na Universidade de Pequim relatou “desmetilação activa do ADN” específico do género em células cancerosas dos ovários, e o laboratório de Zhu Health nos EUA descobriu e identificou demetilases de ADN em plantas. No entanto, as metileterases de DNA de mamíferos ainda são “não identificadas” e “desconhecidas”. Em 2008, dois artigos publicados na Nature por um consórcio de laboratórios alemães e laboratórios franceses relataram uma desmetilação activa localizada do ADN em células portadoras. Nesta altura, Bestor da Universidade de Columbia, um sub-líder no campo da metilação do ADN, saiu e comentou a história em Cell com um tom sarcástico (The colorful history of active DNA demethylation). Anteriormente, o biólogo de desenvolvimento Niehrs de Heidelberg relatou na Natureza que uma proteína de ADN induzida por danos, Gadd45a, promove a desmetilação do ADN, mas imediatamente desenhou uma refutação tetina por tatuagem. O laboratório Pfeifer do Instituto Beckman na Califórnia, EUA, publicou um artigo no PLoS Genet rejeitando os resultados do Niehrs com o título tito-por-tato: GADD45A não promove a desmetilação do ADN! No entanto, vários relatórios subsequentes de diferentes laboratórios confirmaram os resultados do Niehrs. No entanto, ainda existem alguns problemas: 1) o Gadd4a não impede o desenvolvimento embrionário e não afecta o processo de desmetilação antes da fertilização, 2) o CADD4a não é realmente uma enzima de desmetilação, apenas inicia um mecanismo de reparação de ADN chamado reparação de excisão de ácido nuclear (NER), que é utilizado principalmente para reparar danos no ADN causados pela luz UV. Apenas inicia um mecanismo de reparação de ADN chamado reparação de excisão de ácido nuclear (NER, utilizado principalmente para reparar danos no ADN causados pela luz UV), que corta uma secção de ADN metilado e sintetiza um novo cordão. É compreensível que este mecanismo funcione na desmetilação local ou individual de um género específico, mas receio que seja inaceitável como mecanismo geral envolvido na reprogramação da metilação em todo o genoma. Para usar uma analogia, se quisesse mudar a cor de uma parede, preferia remover os tijolos da parede e substituí-los por novos, ou apenas remover a tinta dos tijolos? Especialmente se for uma grande mudança para um edifício inteiro? Afinal, é uma questão de eficiência, por um lado, e de economia, por outro. Finalmente, em 2009-2010, a DNA demetilase tomou o centro do palco e tornou-se uma nova estrela brilhante. A descoberta e a identificação de DNA demetilases representa dois modelos de investigação diferentes (dois modelos de investigação, dois mecanismos e meio, sete moléculas). Impulsionado por hipóteses Este é o modelo clássico da investigação científica, onde uma hipótese é primeiro formulada e depois uma experiência é concebida para a testar. As hipóteses são frequentemente erradas e são, portanto, uma estratégia de alto risco para nós em geral. O sucesso nesta estratégia requer não só intuição, imaginação e coragem, mas também experiência e uma base sólida, e é claro que as capacidades de raciocínio lógico são essenciais. Apreciar a investigação científica de alto nível pode por vezes ser tão intelectualmente agradável como ler casos de detectives Sherlock Holmes. No caso da investigação da desmetilação do ADN, podemos apreciar dois exemplos de investigação orientada por hipóteses. Primeiro, Anjana Rao, anteriormente imunologista do Departamento de Patologia da Universidade de Harvard, agora no Instituto La Jolla de Investigação Metabólica na Califórnia, foi eleita para a Academia Americana de Ciências em 2008. Ela não era originalmente da comunidade epigenética, mas todos são todos, e quando atacam, atacam em grande escala, tal como Shi Yang, que não era originalmente especializada na modificação da metilação da história, mas foi inspirada para invadir o território epigenético e ainda assim fez uma descoberta surpreendentemente importante. A ideia de Rao de que a desmetilação do ADN pode ser por um mecanismo de oxigenação (hidroxilação ou adição de mono oxigenação) pode ter sido inspirada por estudos de um organismo modelo, o tripanossoma africano. Nos tripanossomas existe uma enzima, JBP1, que adiciona um oxigénio (hidroxilação) ao grupo metilo da timina para formar um grupo hidroxil, ao qual outras enzimas ligam depois um grupo de açúcar, formando assim uma estrutura única (denominada estrutura J) que, embora não remova o grupo metilo original, desempenha um papel na regulação da expressão genética. A timina e a metilcitosina são muito semelhantes em estrutura (ambos são anéis de pirimidina), com o grupo metilo na mesma posição, e Rao fez a hipótese de que enzimas e mecanismos semelhantes podem existir em organismos superiores. Com base nesta hipótese, realizaram múltiplas pesquisas de homologia através de sequências de proteínas (PSI-blast) e finalmente encontraram três genes, Tet1, 2 e 3, nas bases de dados de proteínas humanas e murinas. Estes genes foram também encontrados a prevalecer no filo pós-natal, sugerindo a importância e conservação deste mecanismo funcional. Através de análises citológicas e bioquímicas, fizeram duas descobertas importantes: 1. confirmaram que as três proteínas têm uma modificação oxigenada da citosina metilada, mas com diferentes intensidades de actividade, que deveria ser o resultado esperado do seu projecto; 2. a citosina metilada é catalisada pela reacção de oxigenação para formar uma nova forma modificada, a hidroxil-metil-citidina (hm-C). ctidina (hm-C), uma modificação que confere novas propriedades epigenéticas e informação ao ADN; esta segunda descoberta foi inesperadamente não planeada e pode ter implicações ainda mais abrangentes. Imediatamente a seguir, rapidamente impulsionaram o seu trabalho, ligando esta modificação à diferenciação das células hematopoiéticas (Science 2009) e descobrindo também que as suas anomalias (mutações Tet2, supressões) estavam fortemente associadas à tumourigénese hematológica (Nature 2010). Uma figura estelar em epigenética, Yi Zhang, também interveio rapidamente nesta altura e descobriu que as modificações de hidroximetil-citosina mediadas por Tet1 desempenham uma função importante na manutenção da função de auto-renovação (renovação) das células estaminais (Nature 2010). Em 2011, os trabalhos sobre a modificação da hidroximetilação do ADN tornaram-se uma característica regular da Natureza (Natureza 18 Jul 2010; Natureza 30 Mar 2011; Natureza 03 Abr 2011; Natureza, 13 Abril 2011, Célula 14 Abril 2011). Old Dog, New Tricks Este é também um achado típico de Hipótese. O seu modelo teórico é que o uracil, formado pela desaminação da metilcitosina, só pode ocorrer no RNA, e se ocorrer no ADN, ou porque a célula pensa que foi misturado com o material errado durante a síntese ou porque está quimicamente danificado por uma base, em suma, a célula desencadeia uma reparação da excisão de base (reparação da excisão de base). (reparação da excisão de base, RIC), que tem semelhanças com o RNI. Foi nesta altura que uma molécula, a AID (deaminase base de citosina), que foi descoberta no início dos anos 90 para desempenhar um papel importante na capacidade de desenvolvimento do sistema imunitário, entrou na mente daqueles que exploravam as desmetilases de ADN. A AID foi originalmente clonada no laboratório do renomado imunologista japonês Honjo T. A clonagem e elucidação funcional da AID foi um grande passo em frente para o desenvolvimento das células B e a formação da diversidade de anticorpos. O sistema utilizado por M. Azim Surani e Wolf Reik desta vez eram células germinativas primárias. Nas células eliminatórias da AID, ambos os laboratórios descobriram que a desmetilação do esperma foi significativamente afectada, mas ainda assim ocorreu parcialmente, sugerindo a existência de outros mecanismos. No final, ambos confirmaram que a desmetilação envolvida na AID é realizada iniciando a reparação da excisão de base através da desaminação de citosinas metiladas. É como retirar certas partes de um edifício inteiro e substituí-las por novas. Não é suficientemente económico, mas acontece, e só podemos confiar em factos sobre a experiência e o senso comum. Modelo de Investigação 2: Filtragem Sistemática E se não houver pistas, pistas, ideias (hipóteses)? Lançar uma rede e pescar para eles, sistematicamente. Stephen J. Elledge fez a sua fortuna ao construir um poderoso sistema de rastreio RNAi, uma “rede” super dimensionada e super-poderosa. Construiu este super sistema de pesca como um barco de pesca de tamanho exagerado, equipado com uma rede de tamanho exagerado (para capturar todos os genes), automatizado (sistema de código de barras + chip de genes), e tornou-se o rei do mar na investigação genómica funcional. Em 2009, o laboratório de Yi Zhang na Carolina do Norte concebeu uma experiência engenhosa utilizando óvulos fertilizados e conseguiu abrir uma pequena lacuna. Primeiro conceberam um método para detectar o estado de metilação do ADN genómico em células vivas. Existe uma classe de proteínas em células que reconhecem e ligam especificamente o ADN metilado (MBD), e se o MBD estiver ligado (fundido) a uma proteína fluorescente verde, é equivalente a adicionar uma etiqueta fluorescente ao MBD, permitindo que a localização do MBD seja directamente observada e rastreada sob o microscópio. Em geral, MBD-GFP liga-se ao ADN metilado no genoma e aparece como uma mancha verde (focos) sob o microscópio de fluorescência; quando a metilação genómica é removida, MBD-GFP não tem mais nenhum sítio para se ligar e por isso está disperso no núcleo, onde sob o microscópio essas manchas verdes fluorescentes originais desaparecem e tornam-se verdes difusas. Desta forma, as alterações na metilação genómica podem ser determinadas pela observação de alterações no sinal fluorescente. Com este indicador de julgamento é possível rastrear. Os genes seleccionados são “removidos” um a um por interferência de RNA e depois o sinal de fluorescência é observado. Se o sinal fluorescente semelhante à mancha no óvulo fertilizado não desaparecer ou desaparecer muito lentamente depois de um gene ter sido interferido, isto sugere que o gene pode estar envolvido no processo de desmetilação genómica. Este era um ecrã muito grande, com 4.000 genes rastreados, e finalmente surgiram um candidato positivo, que se revelou ser um factor de alongamento transcripcional, ELP3, cujo mecanismo exacto ainda não é claro. Recentemente, Song Hongjun, um cientista chinês da Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins, publicou um artigo de investigação na última edição da Cell que unifica a reacção de hidroximetilação catalisada por Tet1 com a reacção de desaminação catalisada por AID. A placa de desmetilação de ADN, outrora revestida a ferro, foi finalmente aberta; com certeza, há muito ouro e prata lá em baixo, não queres espremer e agarrar algum?