WU Hanqing WANG Bo ZHU Shikai ZHANG Jianjun WANG Chunyou WU Heshui* [Resumo] Objectivo Detectar a expressão do TLR9 no cancro pancreático humano e nas células cancerosas pancreáticas, investigar o efeito do CPG ODN2216 no comportamento biológico das células Panc-1 e explorar o seu significado clínico. Métodos A alta expressão da proteína TLR9 nos tecidos do cancro pancreático foi confirmada pela imuno-histoquímica, e a sua alta expressão na linha celular do cancro pancreático Panc-1 foi confirmada pela imunofluorescência. Os efeitos da CPG ODN2216 na adesão, motilidade e proliferação celular foram investigados por adesão celular, ensaio de raspagem, ensaio de invasão, clonagem celular e ensaio de valor acrescentado MTT. Os resultados mostraram que tanto os espécimes de cancro pancreático humano como a linha de células de cancro pancreático humano Panc-1 foram altamente expressos em TLR9, e a adesão e motilidade celular do CPG ODN2216 foram significativamente inferiores aos do grupo de controlo não sequenciado no ensaio de raspagem, ensaio de adesão in vitro, ensaio de invasão de gel de estroma e ensaio de clonagem celular. A actividade de valor acrescentado era dependente do tempo. Conclusão O gene TLR9 está associado ao potencial metastático invasivo do cancro pancreático humano, e a utilização de ligantes exógenos CPG ODN2216 pode inibir significativamente a capacidade invasiva e migratória das células cancerosas pancreáticas humanas Panc-1. 武汉协和医院急诊科吴汉青【关键词】CPG ODN2216, 胰腺肿瘤, Toll样受体9,细胞生物学 Influence of CPG ODN down-regulation on biology of pancreas cell line PANC-1 and the expression of TLR9 in human pancreatic cancerHan-Qing Wu, Bo Wang, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Chun-You Wang, He-Shui WuDepartment of Pancreatic Surgery Center ,Union Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan Hubei 430022,ChinaCorrespondence to: Professor He-Shui Wu, Email:[email protected].[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer and investigate the effect of CPG ODN2216 on biological behavior of the pancreatic cell carcinoma, and to explore their clinical significance. Methods: The immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 protein in the pancreatic cancer tissue and immunofluorescence staining was also performed to detect the TLR9 protein expression in pancreatic carcinoma cells．In vit O TLR9, contudo, é um membro importante desta família e estimula a expressão de um grande número de citocinas e quimiocinas, tais como a interleucina (IL)-12, IL-6, interferon-γ, proteína inibidora de monócitos e proteases metalloplásmicas, por células B e células dendríticas [2]. Para investigar o papel do gene TLR9 na carcinogénese pancreática, após confirmar a sua elevada expressão no cancro pancreático, utilizámos o oligodeoxinucleótido sintético 2216 (CPG ODN2216), um ligando específico do TLR9, para estimular as células cancerosas pancreáticas Panc-1, e observámos o crescimento e proliferação de células cancerosas pancreáticas, a capacidade tumourigénica e Os resultados mostraram que o gene TLR9 desempenha um papel no desenvolvimento e crescimento de células cancerosas do pâncreas e fornece informações para o estudo adicional do mecanismo específico do gene TLR9. 1. Materiais e métodos I. Materiais experimentais 1. Células: As células cancerosas do pâncreas humano Panc-1 foram fornecidas pelo Laboratório de Cirurgia Geral do Hospital Union, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology. 2. cortes de tecido: 30 casos de tecidos de cancro pancreático fresco humano e tecidos paracancerosos correspondentes (1-2 cm de acordo com a margem do tumor) foram obtidos de doentes com cancro pancreático, 10 casos de amostras de tecido pancreático normal foram obtidos de doentes sem tumor que necessitaram de pancreatectomia parcial por outras razões. Todos os espécimes provinham de doentes com cancro do pâncreas que foram submetidos a tratamento cirúrgico no Centro de Cirurgia Pancreática da Faculdade de Medicina da Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong e foram confirmados por patologia pós-operatória. 3. reagentes primários: CpG-ODN2216 (sequência GGGGACGATCGTCGGGGGGG), sintetizada pela Shanghai Bioengineering Bioengineering Service Co. anticorpo monoclonal (empresa de sinalização celular). kits de imunohistoquímica e fluorescência (Wuhan PhD Company). transwell (Coring Company). matrigel gel (Sigma Company); MTT com DMSO (sigma Company). II. métodos experimentais 1. química da imunocitofluorescência: As células Panc-1 do cancro pancreático foram digeridas com tripsina para fazer uma única suspensão celular, a qual foi largada em lâminas. As lâminas rastejantes foram retiradas no momento certo durante 24 h ou mais, dependendo do estado de crescimento celular. três enxaguamentos com PBS durante 5 min de cada vez, fixados com paraformaldeído a 4% durante 15 min; três enxaguamentos com PBS e perfurados com Triton a 0,5% durante 20 min; três enxaguamentos com PBS e fechados com BSA a 5% durante 30 min; depois de sacudir o líquido, o anticorpo primário diluído foi adicionado directamente, e o grupo de controlo foi substituído por PBS Anticorpo primário. Incubar durante a noite a 4°C; enxaguar três vezes com PBS, adicionar anticorpo secundário diluído e incubar durante 1h a 37°C; enxaguar três vezes com PBS, adicionar SABC-FITC diluído e incubar durante 30min a 37°C; enxaguar três vezes com PBS, selar com selante hidrossolúvel e observar por microscopia de fluorescência. 2. Imunohistoquímica: as secções da parafina foram desparafinadas e hidratadas em álcool. 3% de peróxido de hidrogénio foi embebido à temperatura ambiente durante 10min. As secções foram reparadas antigenicamente em tampão citrato 0,01moL (pH 6,0). As secções foram bloqueadas com 5% de soro de cabra BSA à temperatura ambiente durante 30 min e a solução de bloqueio foi descartada. Adicionar anticorpo primário devidamente diluído, controlar com PBS em vez de anticorpo primário, durante a noite a 4°C. Lavar 3 vezes com PBS durante 5 min cada; adicionar anticorpo secundário marcado com biotina e incubar durante 30 min à temperatura ambiente, lavar 3 vezes com PBS; adicionar SABC e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. lavar com PBS seguido de coloração DAB, re-mancha de hematoxilina, desidratação, transparência, bloqueio e observação microscópica dos resultados. 3. brometo de difeniltetrazólio Método azul (MTT) para detectar a proliferação de células cancerosas do pâncreas: A suspensão de células cancerosas do pâncreas digeridas foi inoculada a 1×103/bolo numa placa de cultura de 96 poços com 100μl por poço. 37°C, 5% de CO2 e condições de humidade saturada foram incubadas, e após 24h de colocação das células, as células foram incubadas com diferentes concentrações (0.1μg/ml, 0.10μg/ml, 1μg/ml, 1μg/ml, 100μl/ml ) de células de acção CPG ODN2216 Panc-1, 24 h, 48 h e 72 h após incubação, respectivamente, foi adicionado 20 μl de MTT a uma concentração de 5 mg/ml; 4 h de incubação, o sobrenadante foi descartado, o sulfóxido de dimetilo foi adicionado, 150 μl/bolo, agitado e misturado, e o valor A foi determinado a um comprimento de onda de 490 nm utilizando um padrão enzimático. Taxa de inibição = (Um controlo – Um grupo de drogas)/Um controlo × 100% [3]. A curva de inibição da proliferação foi traçada e a concentração de meia inibição (IC50) foi medida. 4. Ensaio de raspagem: a suspensão celular Panc-1 a uma concentração celular de 2×105/ml foi adicionada a uma placa de 6 poços a 3ml por poço e incubada durante 24h ou mais. Depois de o crescimento celular ter atingido 80% cheio, o meio de cultura foi descartado e o CPG ODN2216 a concentrações de 1μg/ml e 10μg/ml, respectivamente, foi adicionado e o meio de cultura continuou durante 24h. O sobrenadante foi descartado e um raspador de células foi usado para fazer um arranhão nas células no centro do poço. 4 marcas foram feitas em intervalos iguais ao longo da margem do arranhão como pontos de dados e o valor médio foi tomado. 5. ensaio de aderência celular: placas de 96 poços foram laminadas, secas ao ar, bloqueadas com BSA e incubadas durante 60 min; a concentração celular dos grupos controlo e experimental (CPG ODN 1μg/ml e 10μg/ml durante 24 h) foi ajustada para (5×105)/ml, inoculada com 200μL/bolo, incubada durante 1 h, lavada com PBS, adicionada 5mg/ml MTT e incubada durante 4 h. A taxa de inibição de aderência celular (%) = (Um grupo de controlo – Um grupo de medicamentos)/Um grupo de controlo × 100%. Foram criados três poços secundários para cada grupo de células e foi tomado o valor médio. 6. Ensaio de invasão celular: 30 μL de gel de membrana artificial de porão foi adicionado ao lado da câmara superior da membrana Transwell e seco ao ar. 200 μL (contendo 1×105 células) de células foram adicionados à cultura de fome durante 24 h respectivamente, e a concentração de CPG ODN foi ajustada para 1 μg/ml e 10 μg/ml. 500 μL da câmara inferior da célula de invasão contendo 10 Após 24 h, as câmaras foram removidas e as células não transferidas e o excesso de líquido na câmara superior foram limpos com um cotonete. As câmaras foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 10 min e depois coradas com violeta cristal a 1% durante 30 min. As membranas foram bem lavadas com água desionizada. As células foram observadas e contadas sob um microscópio. Foram criados três poços secundários para cada grupo de células e foi tomado o valor médio.7. Experiência de clonagem celular: as células Panc-1 foram digeridas com trypsin, sopradas para fazer uma única suspensão celular e inoculadas numa placa de 6 poços com cerca de 200 células/poço, montadas como um grupo sem CPG e uma concentração de 1μg/ml e 1μg/ml de CPG respectivamente, com 2 poços secundários para cada grupo de células. As células inoculadas foram incubadas na incubadora até 14 d. A cultura foi terminada quando os clones celulares eram visíveis a olho nu, o meio de cultura foi removido, lavado com PBS, corado com hematoxilina durante 30 min, lavado com PBS, a taxa de formação de clones celulares foi contada e fotografada digitalmente. A experiência foi repetida três vezes. 8. análise estatística: Os dados experimentais foram analisados pelo software SPSS13.0, e todos os dados foram expressos como média ± desvio padrão. o teste t foi realizado para determinar se as diferenças entre os dados experimentais de cada grupo eram estatisticamente significativas. p